【摘 要】
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[背景]虽然骨科基础、临床研究有了很大的进步和发展,但是关节软骨损伤的治疗仍然是一个难以解决的问题.众所周知,部分软骨损伤不能自行修复,而全层骨软骨损伤能够由纤维软骨修复,但是这种修复组织缺乏正常软骨组织所具有的生物学、生物化学、和生物力学特性,因此在关节活动过程中,压力的刺激下,很容易退变.为此,各种各样的手术(如转孔术、关节成形术、微骨折等),被应用于临床,试图刺激骨髓干细胞,产生具有接近透明
【机 构】
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解放军总医院全军骨科研究所,100853
【出 处】
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2006年全国骨科临床研究新进展研讨会
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[背景]虽然骨科基础、临床研究有了很大的进步和发展,但是关节软骨损伤的治疗仍然是一个难以解决的问题.众所周知,部分软骨损伤不能自行修复,而全层骨软骨损伤能够由纤维软骨修复,但是这种修复组织缺乏正常软骨组织所具有的生物学、生物化学、和生物力学特性,因此在关节活动过程中,压力的刺激下,很容易退变.为此,各种各样的手术(如转孔术、关节成形术、微骨折等),被应用于临床,试图刺激骨髓干细胞,产生具有接近透明软骨特性的软骨来修复软骨缺损,但事实证明,这些修复组织在压力刺激下很快发生退变.
[目的]本研究试图以接近人类膝关节解剖结构的中国山羊为动物模型,研究它的软骨细胞在体外分离,培养、快速扩增的方法;在藻酸钙培养中的特性;观察自体软骨细胞复合藻酸钙修复山羊膝关节负重区软骨缺损的结果,以及修复过程中CPM(continuouspassivemotion,持续被动活动仪)对修复结果的影响.
[方法](1)取肩关节软骨组织,体外分离、培养软骨细胞、对培养的软骨细胞进行蕃红"O"、甲苯胺兰及Ⅱ型胶元免疫组化染色等表型鉴定.(2)将鉴定证实为具有正常表形的软骨细胞和cyteodex-3放入RCCS(rotarycellculturesystem,旋转细胞培养系统)培养,和单层培养做对比,观察微载体表面细胞的生长情况,用DNA的变化定量,观察两种培养方式细胞扩增的情况,并对RCCS培养的软骨细胞进行表型鉴定.(3)将鉴定证实为具有正常表形的软骨细胞和藻酸钙凝胶复合,观察藻酸钙凝胶内细胞的生长情况,用荧光分光光度计和紫外分光光度计观察DNA及GAG的量的变化,同时对藻酸钙凝胶培养的软骨细胞进行表型鉴定.(4)收集经藻酸钙培养的软骨细胞和基质,体外培养组织工程化软骨并对其进行组织学和免疫组化鉴定.(5)于山羊股骨髁负重面行直径6mm全层软骨缺损,分别以空白(缺损内未植入任何组织);骨膜覆盖;藻酸钙凝胶填充缺损+骨膜覆盖;复合自体软骨细胞的藻酸钙填充缺损+骨膜覆盖;复合自体软骨细胞的藻酸钙填充缺损+骨膜覆盖+CPM治疗两周,五种方式治疗,分别于3个月、6个月取材(复合自体软骨细胞的藻酸钙填充缺损+骨膜覆盖+CPM有12个月组),进行大体观察,组织学检查和病理评分.
[结果](1)由肩关节软骨组织培养的软骨细胞、RCCS扩增的软骨细胞、短期培养的复合软骨细胞的藻酸钙凝胶,经蕃红"O"、甲苯胺兰及Ⅱ型胶元免疫组化染色均为阳性,证实具有正常软骨细胞的表型;软骨细胞快速贴附于微载体,RCCS能够快速扩增软骨细胞,12天内能够扩增15～17倍.(2)藻酸钙为支架培养的软骨细胞能够维持球形状态,随时间的延长,DNA及GAG的含量逐渐增多;体外培养的组织工程化软骨,经蕃红"O"、甲苯胺兰及Ⅱ型胶元免疫组化染色均为阳性.(3)藻酸钙复合软骨细胞修复羊负重区关节面软骨缺损,从大体观察、组织学、生化动物实验结果进行比较,单因素统计学分析,发现各组均有不同程度的组织修复,复合自体软骨细胞的藻酸钙填充缺损+骨膜覆盖+CPM组效果最好,而且与其他组的区别有统计学意义.[讨论]本研究以藻酸钙为载体,复合软骨细胞修复中国山羊膝关节全厚软骨缺损,从病理评分结果看,其修复效果按递减顺序依次为:藻酸钙复合自体软骨细胞+骨膜覆盖+CPM组、藻酸钙复合自体软骨细胞+骨膜覆盖组、单纯骨膜覆盖组、藻酸钙+骨膜覆盖组、空白组.大体评分单因素统计学分析分析发现,所有未复合细胞组的缺损修复和复合细胞组的修复有统计学差别.病理评分单因素统计学分析分析发现,藻酸钙复合自体软骨细胞+骨膜覆盖+CPM组和其他组有统计学差别,说明CPM明显利于软骨的修复,自体软骨细胞复合支架移植,术后接受CPM关节锻炼是软骨修复的最佳方案.
[结论](1)成功地培养了具有正常表形的羊关节软骨细胞,而且证实了RCCS比普通单层培养更能够快速扩增软骨细胞.(2)藻酸钙凝胶短期培养软骨细胞,能够保持软骨细胞的表型,分泌GAG和Ⅱ型胶元;软骨细胞在藻酸钙凝胶中培养能够增殖.(3)利用藻酸钙介导培养的软骨细胞和分泌的基质,成功地构建了组织工程化软骨,经组织学和免疫组化鉴定,具有正常软骨组织的组织学和生化特性.(4)复合自体软骨细胞及藻酸钙支架填充缺损牛骨膜覆盖+CPM活动,能够修复山羊膝关节负重区软骨缺损.
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