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猪肺炎支原体(Mhp)是猪呼吸道常见致病菌,附着于猪气管上皮细胞表面,造成感染猪上呼吸道表面的物理伤害。分泌型免疫球蛋白A(s Ig A)广泛存在于血液及各种分泌液中,是分泌液重要的免疫蛋白种类,是机体特异性的防御因素。由于体液抗体保护作用不完全,呼吸道局部产生的s Ig A对防治Mhp有较强的作用。很多研究已将s Ig A水平作为疫苗免疫效力的一个指标以及用于Mhp流行病学调查。本研究拟制备猪肺炎支原体s Ig A特异性单克隆抗体,再利用单克隆抗体研究人工感染猪肺炎支原体仔猪的SIg A分布,为将SIg A指标作为一种猪肺炎支原体诊断标准做基础。试验方法:将猪s Ig A蛋白与弗氏完全佐剂按1:1比例充分乳化,以100μg/只的抗原量皮下多点注射5只8周龄BALB/c,2周及4周后将弗氏完全佐剂佐剂换为弗氏不完全佐剂,相同方法进行二免和三免。细胞融合前3d,小鼠腹腔接种200μg抗原进行加强免疫。三天后,无菌分离免疫小鼠脾脏,在PEG作用下与小鼠骨髓瘤细胞SP 2/0融合,待杂交瘤细胞长满至孔底面积的1/10时,间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞。按有限稀释法进行细胞克隆,并建立阳性杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞腹腔注射12周龄BALB/c母鼠,制备并纯化单抗腹水,检测单抗效价、特异性及单抗亚型。选择5头SPF猪,肺内注射猪肺炎支原体活疫苗168株,28天后宰杀,摘取肺脏(有细支气管),肺门淋巴结,小肠,选择抗体效价最高的单克隆抗体作为一抗,免疫组化进行s Ig A分布研究。结果:四次免疫后,小鼠血清中抗猪s Ig A蛋白抗体效价达1:51200。将免疫鼠脾细胞与SP 2/0细胞融合,经3次克隆,成功筛选出3株能分泌猪s Ig A蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名1D8,1F10和1F11。抗体效价检测结果表明,单抗细胞上清和腹水最高效价分别为1:12800和1:106。Western blot检测表明,三株单抗均能识别猪Ig A重链,且不与猪Ig G蛋白发生交叉反应,特异性好。单抗亚型鉴定表明,3株单抗亚型均为Ig G1/κ。选择单抗1F11腹水进行纯化,纯化后抗体纯度灰度扫描值达98%,蛋白浓度为3.044 mg/ml。免疫组化显示SIg A阳性细胞主要分布在细支气管黏膜下层和固有层,肺门淋巴结淋巴滤泡内以及肠道固有层中,SIg A主要分布在气管表面,淋巴结淋巴滤泡以及小肠的肠腺中。讨论:s Ig A是黏膜免疫中的主要效应分子,也是评价黏膜免疫水平的标志性参数;试验中成功制备出猪s Ig A蛋白单克隆抗体,具有特异性好、效价高等特点,这将为准确检测猪s Ig A提供试验材料。