【摘 要】
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目的:设计、合成小鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体,转染小鼠RAW264.7细胞株,筛选出特异性干扰小
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目的:设计、合成小鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体,转染小鼠RAW264.7细胞株,筛选出特异性干扰小鼠RAW264.7细胞株TNF-α生成的8iRNA表达载体,为进一步探讨TNF-α基因表达与关节无菌性松动发生、发展关系奠定了基础,同时为开发以TNF-α基因为靶点的基因治疗方法奠定了实验基础。
方法:小鼠RAW264.7细胞株购自ATCC公司。根据GeneBank中小鼠TNF-αmRNA全长开放读框序列,设计合成两对TNF-α的干扰序列及对照序列,将合成的siRNA寡核苷酸链分别退火形成双链,连接入pSilencer4.1-CMV neo真核表达载体,分别命名为pSilencer-T1和pSilencer-T2,经酶切及测序鉴定。电转染法转染重组质粒入小鼠RAW264.7细胞株,G418筛选稳定转染重组质粒的小鼠RAW264.7细胞株。RT-PCR(Reverse transcriptase-PCR,逆转录PCR)检测小鼠RAW264.7细胞株中TNF-αmRNA相对表达水平,分析重组真核载体的干扰效果。
结果:经酶切及测序鉴定,成功构建siRNA真核表达载体,经电转染法转染小鼠RAW264.7细胞株后,RT-PCR显示所构建的干涉TNF-α基因的真核表达载体与未转染对照组、阴性对照组相比,成功地抑制了目的基因的表达,小鼠RAW264.7细胞株中TNF-α基因的mRNA表达水平明显降低。
结论:成功构建了小鼠TNF-α基因的RNA干涉真核表达载体pSilencer-T1和pSilencer-T2,并在小鼠RAW264.7细胞株中有效地发挥了对TNF-α基因表达的干涉作用。
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