【摘 要】
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目的：通过同源重组方法构建粪肠球菌密度感应调控基因luxS基因缺陷突变菌株.方法：利用PCR扩增粪肠球菌luxS基因的上下游片段(up、dn)口红霉素抗性基因片段(erm),通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物,用胶回收试剂盒纯化扩增产物后保存.将luxS上游同源重组扩增的片段up和pUC18质粒均进行EcoRI和BamHI双酶切,37 ℃酶切后,通过普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收,用
【机 构】
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上海交通大学医学院附属第九人民医院,上海市口腔医学研究所,上海市口腔医学重点实验室,上海 200011
【出 处】
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2014全国口腔生物医学学术年会暨“西湖国际”口腔医学高峰论坛
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目的：通过同源重组方法构建粪肠球菌密度感应调控基因luxS基因缺陷突变菌株.方法：利用PCR扩增粪肠球菌luxS基因的上下游片段(up、dn)口红霉素抗性基因片段(erm),通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物,用胶回收试剂盒纯化扩增产物后保存.将luxS上游同源重组扩增的片段up和pUC18质粒均进行EcoRI和BamHI双酶切,37 ℃酶切后,通过普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收,用T4连接酶与16℃连接过夜.再转入大肠杆菌(E.coli) DH5α,接种LB琼脂培养基,37℃孵育,经酶切鉴定的阳性克隆作为第2步红霉素抗性Erm片段的插入载体Pup.从pResEmMCS10质粒上扩增的Erm片段与Pup载体采用BamHI与PstI双酶切,酶切与连接体系同前所述,经酶切鉴定的阳性克隆作为第3步luxS下游片段的插入载体Puemr.下游片段dn与Puemr载体采用PstI与HinderⅢ双酶切,酶切与连接体系同前所述,经酶切鉴定的阳性克隆即为本研究目的质粒Puemrd重组载体.对本实验所获得的克隆载体Pup,Puemr,Puemrd分别采用相应的核酸内切酶进行双酶切反应,并用1％琼脂糖电泳鉴定质粒；同时,将重组载体送上海生工进行序列测定.将目的质粒Puemrd经EcoRI酶切线性化,胶回收纯化.电击转化前取出感受态细胞于冰浴中解冻,加入线性化外源性DNA,充分混匀后加入至预冷的无菌电转杯中,电击完毕后,37℃低速摇床复苏2h后,将悬液均匀涂布于含含红霉素的LB琼脂培养基上,培养过夜,在含抗性标记的选择性培养基上筛选出阳性克隆.结果：经酶切鉴定目的质粒的上游、下游和红霉素片段插入无误,插入片段的测序报告也显示碱基无错配,使用luxS基因引物扩增发现,粪肠球菌的野生株有目标条带,luxS基因缺陷株在此位置无片段；相反该缺陷株在使用红霉素抗性片段进行扩增后有目标条带,而野生株在此位置无片段；这表明成功构建粪肠球菌luxS基因缺陷株.结论：本研究已成功构建的粪肠球菌luxS基因突变株,为进一步研究该基因在生物膜及其调控机制提供了技术平台.粪肠球菌luxS基因缺陷株基因组采用luxS基因和红霉素抗性片段进行扩增,电泳图谱见图3.由图可见,luxS基因已被敲除缺失,缺失部位被红霉素耐药基因所替代,且替代序列与erm基因无碱基错配,经证实无误.
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