【摘 要】
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目的 观察儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)在儿茶酚促进K562细胞红分化中的作用.方法 K562细胞经儿茶酚处理后,分别用联苯胺染色法和反转录PCR分析氯化高铁血红素诱导的血红蛋白合成和红系相关基因表达,应用HPLC分析培养基儿茶酚经COMT催化产生的愈创木酚的含量.脂质体转染COMT shRNA表达质粒载体(PG PU6/GFP/Neo-COMT-homo-723)并经G418筛选获得稳定敲降C
【机 构】
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北京航空航天大学生物与医学工程学院,北京100191
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目的 观察儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)在儿茶酚促进K562细胞红分化中的作用.方法 K562细胞经儿茶酚处理后,分别用联苯胺染色法和反转录PCR分析氯化高铁血红素诱导的血红蛋白合成和红系相关基因表达,应用HPLC分析培养基儿茶酚经COMT催化产生的愈创木酚的含量.脂质体转染COMT shRNA表达质粒载体(PG PU6/GFP/Neo-COMT-homo-723)并经G418筛选获得稳定敲降COMT的K562细胞系.分析稳定敲降COMT的K562细胞系经儿茶酚处理后,培养基愈创木酚的含量,以及氯化高铁血红素诱导的血红蛋白合成和红系相关基因表达情.结果 K562细胞未经氯化高铁血红素诱导的血红蛋白阳性率低于1％,经氯化高铁血红素诱导的血红蛋白阳性率升高到39.4％；当K562细胞经儿茶酚20,40和80 μmol·L-1处理,然后经经氯化高铁血红素诱导,血红蛋白阳性率进一步升高,处理24 h各浓度儿茶酚组分别升高到41.4％,45.2％和50.7％到39.4％,处理48 h各浓度组分别升高到48.2％,56.7％和67.7％；而且当K562细胞经儿茶酚20,40和80 μmol·L-1处理48 h,然后经经氯化高铁血红素诱导,红系相关基因(包括α-,β-和γ-珠蛋白、血红素合成相关酶PBGD和ALAS2)的mRNA表达水平也出现浓度依赖性升高.当K562细胞经儿茶酚20和40 μmol· L-1处理6 ～48 h,24 h内培养基愈创木酚含量出现时间和浓度依赖性升高,在24和48 h处于稳定水平.反转录PCR分析显示脂质体转染COMT shRNA表达质粒载体并经G418筛选获得稳定敲降COMT的K562细胞系,该细胞系COMT的mRNA表达水平显著低于对照K562细胞；该细胞系经儿茶酚20和40μmol·L-1处理48 h,培养基愈创木酚含量显著低于没有敲降COMT的K562细胞；COMT敲降细胞系经儿茶酚20和40 μmol·L-1处理48 h,然后经经氯化高铁血红素诱导,相对于未经儿茶酚处理细胞,血红蛋白阳性率与各红系相关基因的mRNA表达水平均也没有明显差异.结论 儿茶酚可以促进氯化高铁血红素诱导的K562细胞红系分化,儿茶酚加入K562细胞可经COMT转换产生愈创木酚,敲降COMT可显著减少儿茶酚处理细胞愈创木酚的产生,阻断儿茶酚促进的红系分化,表明COMT催化儿茶酚转换为愈创木酚在儿茶酚促进的红系分化过程中发挥重要作用.
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