【摘 要】
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目的：利用自制微流控芯片(microchip)结合环介导等温扩增(LAMP)技术检测全血样本中JAK2 V617F基因突变,实现对骨髓增殖性肿瘤的分子诊断.方法：设计LAMP检测JAK2 V617F引物,
【出 处】
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第九届全国微全分析系统学术会议、第四届全国微纳尺度生物分离分析学术会议、2014国际微流控芯片与微纳尺度生物分离分析学术
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目的：利用自制微流控芯片(microchip)结合环介导等温扩增(LAMP)技术检测全血样本中JAK2 V617F基因突变,实现对骨髓增殖性肿瘤的分子诊断.方法：设计LAMP检测JAK2 V617F引物,建立并优化反应体系；检测HEL细胞株中JAK2 V617F突变DNA及野生型DNA,对LAMP扩增产物进行测序及酶切鉴定；LAMP检测JAK2 V617F突变率；设计微流控芯片,采用SU-8光刻胶制作阳模,制作聚二甲基硅氧烷/玻璃微流控芯片,选择骨髓增殖性肿瘤患者全血样本,在微流控芯片上进行全血基因组提取,扩增及可视化检测.结果：针对JAK2 V617F序列,设计外引物F3,B3,内引物FIP和BIP及用于突变型检测的引物SM,探针ASO-W；用于野生型检测的引物SW,探针ASO-M；LAMP 反应的最佳体系为：1×ThermoPol buffer、8mMMg2+、1.4mM dNTPs、0.2 μM外引物、1.6μM内引物、2μL模板DNA和8UBst DNA聚合酶.反应条件：63℃恒温1 h.JAK2 V617F突变及野生型LAMP扩增产物测序结果与基因序列一致,采用MseI内切酶将LAMP扩增产物分解为164bp,129bp和56bp三个小片段；LAMP检测JAK2 V617F的突变率可达到0.01％；LAMP-Microchip尺寸为3.0×4.0×0.5cm,分为全血基因组提取区,滤过区,扩增及检测区.在反应液中加入荧光染料钙黄绿素作为结果判断指示剂,1小时内完成全血样本中JAK2 V617F基因突变的检测,可根据反应产物颜色反应直接目测结果(图1).结论：该芯片整合全血核酸提取、扩增和JAK2V617F突变检测,实现sample-to-answer的诊断效果.LAMP-Microchip操作简便、价格低廉、样品用量少,灵敏度高,分析速度快且不依赖仪器,适合于肿瘤分子快速诊断.该芯片体系可以扩展到其他肿瘤分子的早期,快速检测,对于某些重大疾病的基层防治具有重要意义.
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