【摘 要】
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[目的]Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9)技术是基因定点修饰的最新技术,它通过crRNA和Cas蛋白所形成的核蛋白复合物对靶基因的PAM和protospacer序列进行特异性识别,实现基因组的精确修饰.Neuro-2a (N2a)细胞是小鼠神经瘤细胞,
【机 构】
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山东大学公共卫生学院卫生毒理学系,山东济南250012 新泻大学医学部第一生化研究室,日本新泻95
【出 处】
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中国毒理学会第七次全国毒理学大会暨第八届湖北科技论坛
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[目的]Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9)技术是基因定点修饰的最新技术,它通过crRNA和Cas蛋白所形成的核蛋白复合物对靶基因的PAM和protospacer序列进行特异性识别,实现基因组的精确修饰.Neuro-2a (N2a)细胞是小鼠神经瘤细胞,经诱导能分化成神经元样细胞,且对有机磷毒物具有良好的反应性,因此被作为评价有机磷神经毒性的首选细胞株.本研究拟利用CRISPR-cas 9技术制备ATG7基因Knockout的自噬缺陷型N2a细胞,以便于深入地探讨细胞自噬与有机磷化合物的神经毒性之间的关系.[材料和方法](1)设计合成1对ATG7靶向序列(上链：TGTATGAGACCACGAAGTTGAACAGTACCGCC,下链： AAACGGCGGTACTCGTTCAACTTGTGGTCTCA)；(2)ATG7靶向引物变性与Cas9 smart Nuclease Vector的连接；(3)转染E.coli,提取质粒DNA测序验证；(4)将Cas9-ATG7质粒DNA、pBHR-Vector、FuGENE HD按比例混合,转染N2a细胞；(5)荧光显微镜观察N2a细胞GFP表达,利用嘌呤霉素筛选；(6)FACS流式细胞仪单细胞分选培养；(7)提取克隆细胞的DNA,PCR扩增ATG7(上游引物为TGTTTTGGTAGGCTGGTAAG；下游引物为CAATATAGAACGGATGCCCT,利用异源双链泳动分析(HMA)技术检测ATG7突变体；(8)将筛选的ATG7突变细胞培养,Western Blot检测ATG7表达,将筛选出的ATG7-/-细胞扩大培养；(9)利用饥饿诱导法验证自噬活性,即EBSS处理细胞4小时,提取细胞蛋白,Western Blot检测LC3的表达.[结果](1)DNA测序：经DNA测序证实ATG7靶向序列插入到Cas9 smart Nuclease Vector,表明Cas9-ATG7质粒构建成功.(2) HMA检测：Cas9-ATG7质粒转染的N2a细胞经过嘌呤霉素筛选,流式细胞仪单细胞分选培养96孔板5个,2周内共生长出126个细胞克隆中,经HMA检测发现57株ATG7突变细胞.(3) Western Blot检测ATG7表达：ATG7突变细胞扩大培养后,Western Blot检测发现有3株细胞不表达ATG7,即为ATG7-/-的N2a细胞.(4)细胞自噬活性鉴定：上述3株细胞经EBSS处理后,WB检测仅观察到LC3-Ⅰ,未观察到LC3-Ⅱ.在此基础上,我们又利用溶酶体抑制剂(E64d和pepstatinA,EP)阻断自噬降解途径,进一步观察了细胞自噬流的影响,仍未观察到LC3-Ⅱ.实验结果证实上述3株细胞均为自噬缺陷型细胞.[结论]ATG7是自噬体形成中ATG12泛素样连接系统的关键酶.它通过激活ATG12,参与Atg 12-Atg5-Atg 16二聚体的形成,是隔离膜(isolation membrane)延伸并形成自噬体所必需的.在本研究中,我们利用CRISPR/Cas9技术成功制备了ATG7-/-的N2a细胞,经鉴定为自噬缺陷型细胞.
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