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目的：建立高效的绵羊原核胚生产、人工授精、显微注射、胚胎移植转基因技术体系。同时，利用睡美人(Sleeping Beauty，SB)转座系统的高效性、Toll样受体(Toll like receptor，TLR)对广谱抗病能力的开关调节作用及沉默口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1基因表达的特性，构建抗口蹄疫病毒RNAi载体、TLR4表达载体，通过显微注射技术进行抗病转基因绵羊的生产。方法：首先完成抗口蹄疫病毒RNAi靶点筛选、TLR4基因克隆、睡美人转座子结构的改造和转座酶的优化，然后构建抗口蹄疫病毒RNAi载体、TLR4表达载体，筛选高效的绵羊超数排卵方案，最后通过人工授精、显微注射，胚胎移植生产抗病转基因绵羊。结果：本研究采用CIDR+FSH减量+PMSG方案进行超数排卵，平均冲取可用原核胚数为12.95枚；显微注射后移植平均妊娠率为50.98%，产羔率167.9%；注射TLR4基因PCR阳性率为66.70%；注射VP1基因(普通载体)后代阳性率为38.80%；两基因混住时TLR4阳性为33.33%，VP1阳性为58.33%；在北京、天津两地，注射VP1基因(睡美人载体)后代阳性率分别为50.00%、57.14%。结论：本研究显著提高了绵羊原核胚生产、人工授精、显微注射、胚胎移植的效率并批量获得了转TLR4及VP1 RNAi转基因绵羊。