【摘 要】
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目的 探讨一种简单、快捷的不依赖于载体多克隆位点及目的序列的基因亚克隆PCR方法.方法 设计一对针对目的序列及载体序列的PCR上、下游引物,扩增目的序列的引物末端分别和载体序列有18个碱基的重叠,使用高保真的DNA聚合酶进行目的序列和载体序列的扩增,扩增产物混合后,利用DpnI消化降解目的序列及载体的PCR模板,混合物直接用于转化,挑取阳性克隆,测序证明方法的可靠性,提取阳性克隆的质粒,体外转录的
【机 构】
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广州医学院基础学院生物技术系 510182 广州
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目的 探讨一种简单、快捷的不依赖于载体多克隆位点及目的序列的基因亚克隆PCR方法.方法 设计一对针对目的序列及载体序列的PCR上、下游引物,扩增目的序列的引物末端分别和载体序列有18个碱基的重叠,使用高保真的DNA聚合酶进行目的序列和载体序列的扩增,扩增产物混合后,利用DpnI消化降解目的序列及载体的PCR模板,混合物直接用于转化,挑取阳性克隆,测序证明方法的可靠性,提取阳性克隆的质粒,体外转录的mRNA纯化后注入非洲爪蟾卵,进行表达.结果 利用本方法,亚克隆了很多人的尼古丁受体(nAChR)亚基(α4,α9和β2、5-羟色胺受体3A (5-HT3A)到载体pGEMHE,人表皮细胞特异分子2基因到p3XFLAGCMV-14载体,人的Akt3v1、Akt3v2基因到pLXSN载体.pGEMHE载体含有非洲爪蟾β血红蛋白的5及3非翻译区,因此可以在非洲爪蟾卵中进行高效表达,利用上述方法,亚克隆的基因在非洲爪蟾卵中表达水平增加最高达200倍.结论 利用该方法进行基因的亚克隆,不需要PCR产物的胶回收,而且不需要使用针对特定多克隆位点的特异的限制性内切酶,由于本方法使用高保真的DNA聚合酶,PCR扩增仅18个循环,降低了聚合酶所引起的错误扩增所引起的突变,利用该亚克隆方法,证明可以简单、快捷地将目的DNA片段或一个基因的cDNA亚克隆入质粒或载体,具有重复性好、实用的特点,因为该方法不依赖于序列,因此可以用于DNA嵌合体(chimera)的构建、120个碱基范围内的多点突变研究.
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