【摘 要】
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背景 输注血细胞和移植造血干细胞是细胞治疗的常用手段,可以用来治疗遗传性疾病、恶性血液病和重症免疫缺陷等多种疾病.造血系细胞也是采用ex vivo基因治疗策略的重要靶细胞.本研究组前期已经利用人核糖体基因区打靶载体(pHrneo)将人凝血因子IX(hFIX)靶入到人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)的rDNA区,因此将hESCs定向分化成造血系细胞,将为
【出 处】
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中华医学会2012年医学遗传学年会暨全国第十一次医学遗传学学术会议
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背景 输注血细胞和移植造血干细胞是细胞治疗的常用手段,可以用来治疗遗传性疾病、恶性血液病和重症免疫缺陷等多种疾病.造血系细胞也是采用ex vivo基因治疗策略的重要靶细胞.本研究组前期已经利用人核糖体基因区打靶载体(pHrneo)将人凝血因子IX(hFIX)靶入到人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)的rDNA区,因此将hESCs定向分化成造血系细胞,将为今后利用诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)实现血友病B的个体化基因治疗提供实验基础.目的 利用rDNA区定点整合了hFIX的人胚胎干细胞,通过定向分化获得能够表达hFIX的造血系细胞.方法 本研究对人胚胎干细胞系H9以及本室定点整合治疗基因hFIX的hESCs克隆进行了体外定向诱导分化.实验的主要技术是将hESCs培养于低黏附培养皿中形成拟胚体(human embryoid bodies,hEBs),再进一步定向分化成造血系细胞,实验中我们尝试了三种分化诱导方法,spin hEBs法、悬浮-贴壁法和半固体-液体法.在诱导的过程中,我们收集了分化第0-26天的hEBs进行半定量RT-PCR,以鉴定诱导过程中造血标志基因的变化；此外,收集培养11天的hEBs,用流式细胞技术检测其中CD34、CD38等造血表面抗原的表达情况,以确定造血分化的效率；分化26天后,用瑞氏(Wright)一吉姆萨(Giemsa)混合染色从形态学上鉴定分化后所包含的各类成熟的造血系细胞.结果 spin hEBs法未能形成分化所需的hEBs,而悬浮-贴壁法和半固体-液体法均成功的获得了大量的hEBs用于后续分化.半定量RT-PCR技术检测了造血系细胞相关基因的表达变化情况.结果发现,诱导产生的细胞具有造血系细胞的一般特性,表达CD34、TAL-1/SCL、GATA-2、RUNX-1、MIXL-1、FLK-1/KDR等造血相关基因,而且定点整合克隆仍然表达治疗基因人凝血因子Ⅸ.流式细胞检测到CD34、CD38阳性率分别为48.75％和30.98％；此外,瑞氏一吉姆萨混合染色法观测可见红细胞、早幼粒细胞、晚幼粒细胞、杆状核粒细胞、分叶核粒细胞、淋巴细胞、巨核细胞等多种类型造血系细胞.结论 本研究初步建立了定点整合hFIX的hESCs向造血系细胞定向分化的技术平台,也为今后利用iPSCs实现血友病B的个体化基因治疗提供了实验基础.
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