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【摘 要】文章研究了超临界CO2中固定化脂肪酶催化鸡油水解反应的效果。通过单因素实验考察了酶用量、温度、底物浓度、pH、搅拌转速对酶解率的影响，在此基础上采用响应面实验对温度、反应时间、酶量、搅拌转速工艺参数进行优化。实验结果表明：超临界CO2中固定化脂肪酶催化鸡油水解的最佳条件为酶量0.45%、温度42.5 ℃、搅拌转速100 rpm、反应时间106.401 min，水解率为85.84%。
【关键词】超临界CO2;脂肪酶;鸡油
【中图分类号】O643 【文献标识码】A 【文章編号】1674-0688（2019）04-0076-03
0 引言
动物脂肪在超临界CO2中脂肪酶催化反应性质研究较少，盛梅、曹国民研究了脂肪酶催化猪油和牛油水解的工艺。Adamczak等研究Rhizomucor miehei和Yarrowia lipolytica脂肪酶的性质，间接研究了其水解牛油的性质。Jackson等研究了超临界CO2中脂肪酶催化甘油解大豆油反应。Holmberg等在超临界CO2中利用脂肪酶435（Candida antarctica）催化植物油与甲醇制备脂肪酸甲酯。本文研究超临界CO2中固定化脂肪酶催化鸡油水解的工艺条件，为动物脂肪加工提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 实验原料（见表1）
1.2 主要仪器设备（见表2）
1.3 实验方法
1.3.1 乳化液的制备
磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L）、鸡油和1% tween-80经高速剪切（5 000 rpm×5 min，40 ℃）形成初乳液，之后在50 MPa经二级均质形成乳液。
1.3.2 皂化值、酸值、水解率测定
带搅拌的反应釜中加入乳液和酶制剂，在既定反应温度反应一定时间后，取反应物溶于15 mL乙醇-丙酮（1∶1，v/v）中止其反应，并用0.1 mol/LKOH溶液滴定酸值（AV）。
水解率（%）=（水解物AV-初始油脂乳液AV）/油脂皂化值
2 实验结果
2.1 单因数实验结果
2.1.1 酶量对鸡油乳液水解率的影响（见表3）
实验结果如图1所示，0.1%～0.6%（w/w）酶量范围内，水解率随着酶量的增加而增加，但酶浓度增加到一定的饱和程度，反应速率就不再因酶浓度的增加而提高。
2.1.2 反应温度对鸡油乳液水解率的影响（见表4）
温度影响酶的活性、稳定性及反应体系本身。高温会增加酶变性的机会，从而导致酶催化反应速率下降。因此，通常会有一个最适反应温度，该温度与酶种类、载体、固定化方法和反应介质有关。在超临界CO2中，酶活性的损失与降压速率和系统含水量相关。实验结果如图2所示，反应最适温度为40 ℃。
2.1.3 底物浓度对鸡油乳液水解率的影响（见表5）
相行为在高压CO2体系水解反应中起着重要作用。油水解生成的二甘油酯、单甘油酯和脂肪酸低于它们的饱和度，应该完全溶于超临界介质中。实验结果如图3所示，10%～50%底物浓度范围内，在较短的反应时间内，水解率随着底物浓度的增加而增加，但随着反应时间的延长，水解率随着底物浓度的增加略有下降。
2.1.4 pH对鸡油乳液水解率的影响（见表6）
酶分子结构复杂，基团随pH值的变化可以处于不同的解离状态，从而影响酶的催化活性。实验结果如图4所示，最适反应pH值为6.5。
2.1.5 搅拌转速对鸡油乳液水解率的影响（见表7）
传质速率取决于介质的物理特性、粉末形态、温度和体系的流体力学（搅拌/流速）。在超临界CO2中，外部传质受CO2流速的影响。实验结果如图5所示，搅拌转速的增加可以提高水解率，但结合经济能耗考虑，最适搅拌转速为100 rpm。
2.2 响应面实验结果
根据单因素实验确定反应温度为35～50 ℃，反应时间为 30～90 min，酶量为0.3%～0.6%，搅拌转速为50～150 rpm的取值范围，利用响应面分析法对实验条件进行优化。本实验采用Box-Behnken中心组合设计对脂肪酶水解鸡油乳液的工艺进行优化。按照设计的实验点进行实验，得出各实验点下的水解率（见表8）。
3 结语
超临界CO2中Candida cylindracea脂肪酶催化鸡油水解的最佳条件为酶量0.45%、温度42.5 ℃、搅拌转速100 rpm、反应时间106.401 min，水解率为85.84%。
参 考 文 献
[1]盛梅，曹国民.蚕丝固定化脂肪酶催化猪油水解[J].中国油脂，1999（4）：36-38.
[2]曹国民，盛梅，高广达.脂肪酶催化动物脂肪水解[J].中国油脂，1997（2）：29-30.
[3]Adamczak M，Bednarski W.Enhanced activity of intracellular lipases from Rhizomucor miehei and Yarrowia lipolytica by immobilization on biomass support particles[J].Process Biochemistry，2004（39）：1347-1361.
[4]Jackson M A，King J W.Lipase-catalyzed glycerolysis of soybean oil in supercritical carbon dioxide[J].J Am Oil Chem Soc，1997，74（2）：103-106. [5]Holmberg K，Lassen B，Stark M B.Enzymatic glycerolysis of a triglyceride in aqueous and nonaqueous microemulsions[J].J Am Oil Chem Soc，1989，
66（12）：1796-1800.
[6]GB/T 5534—1995，動植物油脂皂化值的测定[S].
[7]M Primozic，M Habulin，Z Knez.Parameter optimization for the enzymatic hydrolysis of sunflower oil in high-pressure reactors[J].JAOCS，2003，80（7）：643-646.
[8]C Turner，M Persson，L Mathiasson，et al.Lipasecatalyzed reactions in organic and supercritical solvents：application to fat-soluble vitamin determination in milk powder and infant formula[J].Enzyme and Microbial Technology，2001（29）：111–121.
[9]M Habulin，Z Knez.High-pressure enzymatic hydrolysis of oil.Eur.J.Lipid Sci.Technol，2002（104）：381-386.
[10]C Turner，J W King，T Mckeon.Selected uses of enzymes with critical fluids in analytical chemistry[J].Journal of AOAC International，2004，87（4）：797-810.
[11]N K Guthalugu，M Balaraman，U S Kadimi.Optimization of enzymatic hydrolysis of triglycerides in soy deodorized distillate with supercritical carbon dioxide.Biochemical Engineering Journal，2006（29）：220–226.
[12]S V Kamat，E J Beckman，A J Russell.Enzyme activity in supercritical fluids[J].Critical Reviews in Biotechnology，1995，15（1）：41-71.
[13]Yao Yan，K Nagahama.Activity of free candida rugosa lipase in hydrolysis reaction of tuna oil under high pressure carbon dioxide[J].Journal of Chemical Engineering of Japan，2003，36（5）：557-562.
[14]H Sovova，M Zarevucka.Lipase-catalysed hydrolysis of blackcurrant oil in supercritical carbon dioxide[J].Chemical Engineering Science，2003（58）：2339-2350.
[15]A J Mesiano，E J Beckman，A J Russell.Supercritical biocatalysis[J].Chemical reviews，1999（99）：623-633.
[责任编辑：钟声贤]
【关键词】超临界CO2;脂肪酶;鸡油
【中图分类号】O643 【文献标识码】A 【文章編号】1674-0688（2019）04-0076-03
0 引言
动物脂肪在超临界CO2中脂肪酶催化反应性质研究较少，盛梅、曹国民研究了脂肪酶催化猪油和牛油水解的工艺。Adamczak等研究Rhizomucor miehei和Yarrowia lipolytica脂肪酶的性质，间接研究了其水解牛油的性质。Jackson等研究了超临界CO2中脂肪酶催化甘油解大豆油反应。Holmberg等在超临界CO2中利用脂肪酶435（Candida antarctica）催化植物油与甲醇制备脂肪酸甲酯。本文研究超临界CO2中固定化脂肪酶催化鸡油水解的工艺条件，为动物脂肪加工提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 实验原料（见表1）
1.2 主要仪器设备（见表2）
1.3 实验方法
1.3.1 乳化液的制备
磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L）、鸡油和1% tween-80经高速剪切（5 000 rpm×5 min，40 ℃）形成初乳液，之后在50 MPa经二级均质形成乳液。
1.3.2 皂化值、酸值、水解率测定
带搅拌的反应釜中加入乳液和酶制剂，在既定反应温度反应一定时间后，取反应物溶于15 mL乙醇-丙酮（1∶1，v/v）中止其反应，并用0.1 mol/LKOH溶液滴定酸值（AV）。
水解率（%）=（水解物AV-初始油脂乳液AV）/油脂皂化值
2 实验结果
2.1 单因数实验结果
2.1.1 酶量对鸡油乳液水解率的影响（见表3）
实验结果如图1所示，0.1%～0.6%（w/w）酶量范围内，水解率随着酶量的增加而增加，但酶浓度增加到一定的饱和程度，反应速率就不再因酶浓度的增加而提高。
2.1.2 反应温度对鸡油乳液水解率的影响（见表4）
温度影响酶的活性、稳定性及反应体系本身。高温会增加酶变性的机会，从而导致酶催化反应速率下降。因此，通常会有一个最适反应温度，该温度与酶种类、载体、固定化方法和反应介质有关。在超临界CO2中，酶活性的损失与降压速率和系统含水量相关。实验结果如图2所示，反应最适温度为40 ℃。
2.1.3 底物浓度对鸡油乳液水解率的影响（见表5）
相行为在高压CO2体系水解反应中起着重要作用。油水解生成的二甘油酯、单甘油酯和脂肪酸低于它们的饱和度，应该完全溶于超临界介质中。实验结果如图3所示，10%～50%底物浓度范围内，在较短的反应时间内，水解率随着底物浓度的增加而增加，但随着反应时间的延长，水解率随着底物浓度的增加略有下降。
2.1.4 pH对鸡油乳液水解率的影响（见表6）
酶分子结构复杂，基团随pH值的变化可以处于不同的解离状态，从而影响酶的催化活性。实验结果如图4所示，最适反应pH值为6.5。
2.1.5 搅拌转速对鸡油乳液水解率的影响（见表7）
传质速率取决于介质的物理特性、粉末形态、温度和体系的流体力学（搅拌/流速）。在超临界CO2中，外部传质受CO2流速的影响。实验结果如图5所示，搅拌转速的增加可以提高水解率，但结合经济能耗考虑，最适搅拌转速为100 rpm。
2.2 响应面实验结果
根据单因素实验确定反应温度为35～50 ℃，反应时间为 30～90 min，酶量为0.3%～0.6%，搅拌转速为50～150 rpm的取值范围，利用响应面分析法对实验条件进行优化。本实验采用Box-Behnken中心组合设计对脂肪酶水解鸡油乳液的工艺进行优化。按照设计的实验点进行实验，得出各实验点下的水解率（见表8）。
3 结语
超临界CO2中Candida cylindracea脂肪酶催化鸡油水解的最佳条件为酶量0.45%、温度42.5 ℃、搅拌转速100 rpm、反应时间106.401 min，水解率为85.84%。
参 考 文 献
[1]盛梅，曹国民.蚕丝固定化脂肪酶催化猪油水解[J].中国油脂，1999（4）：36-38.
[2]曹国民，盛梅，高广达.脂肪酶催化动物脂肪水解[J].中国油脂，1997（2）：29-30.
[3]Adamczak M，Bednarski W.Enhanced activity of intracellular lipases from Rhizomucor miehei and Yarrowia lipolytica by immobilization on biomass support particles[J].Process Biochemistry，2004（39）：1347-1361.
[4]Jackson M A，King J W.Lipase-catalyzed glycerolysis of soybean oil in supercritical carbon dioxide[J].J Am Oil Chem Soc，1997，74（2）：103-106. [5]Holmberg K，Lassen B，Stark M B.Enzymatic glycerolysis of a triglyceride in aqueous and nonaqueous microemulsions[J].J Am Oil Chem Soc，1989，
66（12）：1796-1800.
[6]GB/T 5534—1995，動植物油脂皂化值的测定[S].
[7]M Primozic，M Habulin，Z Knez.Parameter optimization for the enzymatic hydrolysis of sunflower oil in high-pressure reactors[J].JAOCS，2003，80（7）：643-646.
[8]C Turner，M Persson，L Mathiasson，et al.Lipasecatalyzed reactions in organic and supercritical solvents：application to fat-soluble vitamin determination in milk powder and infant formula[J].Enzyme and Microbial Technology，2001（29）：111–121.
[9]M Habulin，Z Knez.High-pressure enzymatic hydrolysis of oil.Eur.J.Lipid Sci.Technol，2002（104）：381-386.
[10]C Turner，J W King，T Mckeon.Selected uses of enzymes with critical fluids in analytical chemistry[J].Journal of AOAC International，2004，87（4）：797-810.
[11]N K Guthalugu，M Balaraman，U S Kadimi.Optimization of enzymatic hydrolysis of triglycerides in soy deodorized distillate with supercritical carbon dioxide.Biochemical Engineering Journal，2006（29）：220–226.
[12]S V Kamat，E J Beckman，A J Russell.Enzyme activity in supercritical fluids[J].Critical Reviews in Biotechnology，1995，15（1）：41-71.
[13]Yao Yan，K Nagahama.Activity of free candida rugosa lipase in hydrolysis reaction of tuna oil under high pressure carbon dioxide[J].Journal of Chemical Engineering of Japan，2003，36（5）：557-562.
[14]H Sovova，M Zarevucka.Lipase-catalysed hydrolysis of blackcurrant oil in supercritical carbon dioxide[J].Chemical Engineering Science，2003（58）：2339-2350.
[15]A J Mesiano，E J Beckman，A J Russell.Supercritical biocatalysis[J].Chemical reviews，1999（99）：623-633.
[责任编辑：钟声贤]