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摘要: AFLP 标记是一种新的DNA 分子标记技术。对AFLP 标记的基本原理、技术流程和关键技术做了简要介绍, 从亲缘关系与遗传多样性分析、遗传图谱的构建、特定性状的连锁标记、品种纯度鉴定与QTL 分析等方面概述了AFLP 标记在大白菜遗传育种中的应用进展, 并对其应用前景进行了展望。
关键词: AFLP 标记; 大白菜; 遗传育种
近10 年来, 现代分子生物学技术迅猛发展, 尤其是PCR方法的建立, 引起了分子生物学发展史上的一场革命, 以PCR 为基础的DNA 指纹技术大大加快了人类研究遗传多样性的步伐, 为不同来源和不同复杂程度基因组的分析提供了有力的工具。AFLP( amplified fragment length ploymorphism)技术是由荷兰Keygene 公司科学家Zabeau 和Vos[1]发展起来的1 种检测DNA 多态性的1 种方法, 1993 年获欧洲专利局专利, 专利权归属荷兰Keygene 公司。该方法是继RFLP( restriction fragment length ploymorphism) , SSR( simple sequencerepeat) 和RAPD( random amplifie ploymorphism DNA) 之后发展最快的DNA 指纹技术, 是DNA 指纹技术的重大突破, 也是目前国际上最新最适用的DNA 指纹技术。AFLP 结合了RFLP 和RAPD 的特点, 既具有RFLP 可靠性好、重复性高的特点, 同时又具有PCR 的高效性、安全性和方便性的优点, 不需要了解基因组信息, 且只需少量纯化的基因组DNA 即可对整个基因组DNA 酶切片段进行选择性扩增, 扩增结果产生大量的序列经电泳形成复杂的DNA 指纹, 得以反映基因组细微的变化, 适合所有生物基因组的检测, 因此被认为是迄今为止最有效最理想的1 种DNA 分子标记技术, 目前已广泛应用于多种植物的遗传育种研究。
1 AFLP 技术的基本原理、流程和技术关键
1.1 AFLP 标记的基本原理
AFLP 技术是基于限制性酶切和PCR 技术的DNA 标记,其基本原理是: 通过对基因组DNA 酶切片段的选择性扩增来检测DNA 酶切片段长度的多态性。首先用2 种限制性内切酶将基因组DNA 切割成带粘性末端的分子量大小不等的限制性片段, 然后将这些片段和与其末端互补的已知序列的双链接头( artificial adapter) 连接, 所形成带接头的特异片段作为PCR 反应的模板。PCR 引物5′端与接头和酶切位点互补, 3′端在酶切位点后增加1～3 个选择性碱基, 使得只有一定比例的限制性片段被选择性地扩增, PCR 产物经变性聚丙烯凝胶电泳分离检测。AFLP 扩增片段的谱带数由内切酶及引物3′端选择碱基的种类、数目和基因组的复杂性决定。
1.2 AFLP 技术流程和关键技术
AFLP 技术流程包括:
(1) 基因组DNA 提取。AFLP 分析要求制备高质量、高纯度、高分子量(HMW) 基因组DNA。制备过程中要特别注意避免核酸酶及各种失活物质污染。对模板浓度要求不高, 在浓度相差1 000 倍的范围内, 得到的结果基本一致。当模板浓度低于一定极限时( 1 pg) , Vos P [2] 得到的图谱同样可靠。
(2) 引物选择。PCR 反应过程中酶切片段扩增效率的差异主要与引物有关而与酶切片段无关, 而引物设计主要取决于接头设计, 变化主要在选择性碱基数目及组合上。引物设计遵循规则: 5′端以G 开始, 可有效防止双链形成; 选择性碱基数目一般为3 个。通过控制实验条件和选择碱基数目可以防止错配带产生。引物由三部分组成: 核心碱基序列( coresequence, CORE) , 该碱基序列与人工接头互补; 特异性酶切序列( enzyme specific sequence, ENZ) ; 引物3′—端选择性碱基( selective extension, EXT) 。选择性碱基延伸到酶切片段区, 这样只有那些两端序列能与选择性碱基配对的限制性酶切片段被扩增。
(3)DNA 酶切及人工接头连接。首先对DNA 要进行充分、彻底的酶切( 否则不能反映真实的多态性) 。然后通过热变性对内切酶进行灭活处理。最后在T4 连接酶作用下与接头连接, 作为扩增反应的模板DNA。
酶切的酶有很多种, 包括EcoRⅠ、TaqⅠ、MspⅠ、HpaⅡ、MseⅠ、PatⅠ等。一般采用双酶切。真核生物中A、T 的丰度较高, MseⅠ的识别序列为TTAA, 比其他内切酶可产生分布均匀的较小片段, 因此MseⅠ是一种多切点酶。EcoRⅠ和其他切点较少的酶, 效果相差不大, 而且EcoRⅠ价格较低, 是一种常用的酶。双酶切可以产生3 种片段: EcoRⅠ- EcoRⅠ、MseⅠ-MseⅠ和EcoRⅠ-MseⅠ。
据中国农业大学肖兴国博士[3]报道, 荷兰科学家VanderWurff 等[4]在AFLP 基础上发展了一种新的DNA 指纹技术, 即TE- AFLP( three endonuclease amplified fragment length polymorphism,三内切酶扩增的限制性片段长度多态性) , 与AFLP 不同的是, 基因组DNA 同时用2 种低频率切点内切酶( 通常为6 碱基位点识别酶) 和1 种高频率切点内切酶( 通常为4 碱基位点识别酶) 混合酶切。
(4) 限制性片段的选择性扩增。首先用核心引物进行预扩增, 然后将预扩增产物稀释10～50 倍后用于选择性扩增。预扩增产物为选择性扩增模板, 同时对模板起选择性纯化的作用, 使谱带更清晰和具更好的重复性。一是可减少“Smear”背景污染; 二是可为AFLP 反应提供大量的模板DNA。
(5) 变性凝胶电泳分析。扩增产物在4%～6% 的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离, 根据标记物质进行相应的检测。根据扩增片段长度的不同检出多态性。
2 AFLP 标记在大白菜遗传育种中的应用
2.1 亲缘关系与遗传多样性分析
采用AFLP 等标记技术, 从分子水平上分析白菜各品种、亚种间的亲缘关系, 为研究白菜类蔬菜起源、演化及分类提供理论依据。孙德岭等[5]用AFLP 选择性引物组合对白菜类蔬菜间亲缘关系的研究结果表明, 芜青与结球白菜和不结球白菜亲缘关系远, 而结球白菜与鸡冠菜和毛白菜亲缘关系较近, 与其他不结球白菜亲缘关系较远。郭晶心等[6]用AFLP 标记进行研究后认为, 芜青和白菜类蔬菜各自单独聚为1 类,在白菜类蔬菜当中, 所有大白菜和薹菜是比较特殊的类群,它们亲缘关系密切, 聚为1 类。小白菜各类型间的相似性程度较低, 说明小白菜的起源较大白菜要早。 2.2 遗传图谱的构建
分子标记连锁图为进行植物基因组的结构分析和比较提供了有力工具。较高密度的分子遗传图谱已有效地应用于数量性状的基因定位、图位克隆基因、比较基因组学研究和分子标记辅助育种等研究中。因此, 对于具有重要经济价值的大白菜来说, 构建1 张高密度的遗传连锁图将具有重大意义。于拴仓等[7]利用杂交获得的102 份F6 代重组自交系, 通过对AFLP 和RAPD 2 种分子标记进行遗传分析, 构建了由352 个遗传标记组成的大白菜连锁图谱。王美等[8]以白菜高抗TuMV 白心株系和高感TuMV 橘红心株系为亲本构建DH 作图群体。通过筛选得到了263 个AFLP 多态性位点, 从而构建了1 张含有255 个标记位点、覆盖长度为883. 7 cM的连锁图。在此基础上, 张立阳等[9]构建了包含10 个连锁群、406个标记位点的分子连锁图谱, 图谱总长度826.3 cM。包括246个AFLP 标记、135 个RAPD 标记、11 个SSR 标记和12个同工酶标记、1 个SCAR 标记和1 个形态标记。除以上性状外, 对雄性不育性[10]、晚抽薹[11]、春化时间[12]等也进行了分子标记的研究, 为这些重要农艺性状的辅助选择奠定了基础。
2.3 特定性状的连锁标记
分子标记技术在白菜抗病育种中也得到了应用。韩国的zhong YP 等[13]将BSA 和AFLP 标记相结合, 对DH 群体分析,找到了与大白菜根瘤病连锁的AFLP 标记, 并对其进行了精细作图。韩和平等[14]以抗病自交系和感病自交系杂交后代的F2 代分离群体为试材, 采用BSA 筛选到2 个与TuMV 感病基因紧密连锁的AFLP 分子标记。根肿病[15]、抗黑腐病[16]等也找到了连锁的标记。郑晓鹰等[17]用同工酶及AFLP 分子标记技术鉴定了大白菜耐热性相关的遗传标记, 为大白菜耐热性分子标记辅助选择提供了理论基础。
2.4 品种纯度鉴定
鉴定品种纯度的常规方法是根据田间表型性状进行鉴定, 即费时又费地, 还影响种子销售, 而生化和分子生物学方法不是不准确就是成本过高, 分子标记方法既快速又简便,成本也不太高, 在幼苗或种子阶段就可鉴定出品种的纯度。AFLP 技术很适合用于种子真实性和品种纯度的鉴定。尤其在鉴定像大白菜这类品种间亲缘关系较近、遗传背景较窄的蔬菜品种上具有更大的优势。张增翠等[18]对不结球白菜优质品种矮抗6 号及其父母本进行了AFLP 标记分析, 筛选出的2 对AFLP 引物组合可明确揭示杂种与父母本之间的遗传关系, 可作为鉴定杂种真伪及纯度的指标。
2.5 QTL 分析
作物的很多重要农艺性状: 如产量性状、品质性状、抗虫性、对不良环境因子的耐性, 一般是由多个基因所控制的数量性状。经典的遗传分析方法只能把控制数量性状的多个基因作为一个整体进行研究, 难以有效地研究控制性状表达的基因数目、基因在染色体上的位置以及基因的效应及其作用方式。卢钢等[19]采用区间作图法对白菜地上部主要农艺性状进行了QTL 分析, 发现与叶形、叶柄形状、株高等8 个重要农艺性状连锁的24 个QTLs 位点, 各性状QTL 的数目在1～5个, 各位点之间存在一定的相关关系。于拴仓等[20]采用复合区间作图的方法, 对大白菜叶球相关的7 个农艺性状进行QTL 定位及遗传效应研究。结果表明, 在14 个连锁群上检测到33 个QTLs, 其中控制生育期的QTL 有3 个, 控制外叶数的QTL 有3 个, 控制球高的QTL 有7 个, 控制球径的QTL 有5 个, 控制球叶数的QTL 有4 个, 控制球重的QTL 有4 个。他们还对白菜的耐热性进行了QTL 分析[21]。采用苗期热害指数进行耐热性表型鉴定, 共检测到8 个耐热性QTLs 位点,分布于3 个连锁群上。发现了与5 个QTL 紧密连锁的侧链分子标记, 它们与QTL 间的距离为0.1～2.4 cM。张俊华等以大白菜抗TuMV- C3 株系的抗病自交系和感病自交系杂交的F2 代单株作为构建遗传图谱的作图群体, 通过EST- PCRRFLP和AFLP 分子标记的遗传分析, 构建了大白菜分子遗传图谱并进行了与大白菜抗TuMV- C3 有关的QTL 分析( 待发表) 。
3 展望
由于对基因微小差异的高度敏感, 以PCR 为基础的AFLP 技术将成为一段时期内最主要的分子工具。尽管AFLP存在成本较高, 对技术要求较苛刻等缺点, 但从近几年发表的有关AFLP 论文数量不断上升的趋势看, AFLP 仍不失为分子生物学研究的有力工具。白菜的分子育种研究取得了显著的成绩, 但与水稻、小麦、玉米等大田作物相比, 无论在研究的广度还是深度上, 仍然有较大的差距。培育抗逆特性显著、品质性状优良、对一些关键病害具有较强抗性的新品种, 是我国育种工作者当前最迫切的任务。今后我国白菜分子标记研究应该围绕以下重点进行, 采用与常规技术结合的方法,构建具有我国特色的白菜核心种质资源, 发掘核心资源的重要园艺性状新基因, 明确其利用价值。针对抗病、优质、抗逆相关基因或QTL 进行标记, 在获得紧密连锁的分子标记的基础上, 建立高通量的分子标记技术平台, 开展大规模的分子标记辅助育种研究; 构建相应的分子标记连锁图谱, 对重要经济性状进行多年多点调查, 获得大量基因型与表型关联数据, 开发利用这些数据进行分子设计育种的计算机软件; 为深入开展大白菜分子设计育种奠定理论基础。
参考文献
[1] Zabeau M, Vos P. Selective triction fragment amplification a generalmethod for DNAfingerprints[M]. European Patent Application Puhl,1993.
[2] Vos P, Hogers R, Bleeker M. AFLP: a newtechnique for DNA fingerprinting[J]. NucleicAcidsResearch, 1995, 23( 21) : 4 407- 4 414.
[3] 肖兴国. 一种经济快速高效的DNA 指纹技术— —TE- AFLP 评价[J]. 农业生物技术学报, 2001, 9( 2) : 202- 204.
[4] Vander Wurff AWG, Chan YL, Van Straaln NM, et al. TE- AFLP:combining rapidity and robustness in DNAfinger printing[J]. NucleicAcids Res, 2000, 28 ( 24) : 5 005- 5 009. [5] 孙德岭, 赵前程, 宋文芹, 等. 白菜类蔬菜亲缘关系的AFLP 分析[J]. 园艺学报, 2001, 28( 4) : 331- 335.
[6] 郭晶心, 周乃儿, 马荣才, 等. 白菜类蔬菜遗传多样性的AFLP分子标记研究[J]. 农业生物技术学报, 2002, 10( 2) : 138- 143.
[7] 于拴仓, 王永健, 郑晓鹰. 大白菜分子遗传图谱的构建与分析[J]. 中国农业科学, 2003, 36( 2) : 190- 195.
[8] 王美, 张凤兰, 孟祥栋, 等. 中国白菜AFLP 分子遗传图谱的构建[J]. 华北农学报, 2004, 19( 1) : 28- 33.
[9] 张立阳, 张凤兰, 王美, 等. 大白菜永久高密度分子遗传图谱的构建[J]. 园艺学报, 2005, 32( 2) : 249- 255.
[10] MiaoY, FelixDreyer, Cai D, et al.Molexular markers for genic malesterility in Chinese cabbage[J]. Euphytica, 2003, 132: 227- 234.
[11] Hidetoshi A, Kuginuki YY, Susumu Y, et al. Klentification andmapping of aquanti trait locus xontrolling extremelate bolting in Chinesecabbage using bulkes segregant analysis [J]. Euphytica, 2001,118: 75- 81.
[12] TeutonicoRA, Osborn TC.Mapping loci controlling vernalization requirementin Brassica rapa [J]. Theor Appl Genet , 1995, 91( 8) :1 279- 1 283.
[13] ZhongYP, Park YJ, Deng YQ, et al. Molecular map of clubroot resistancegene in Chinese cabbage(Brassica rapa ssp. pekinensis) [A].In: Plant
关键词: AFLP 标记; 大白菜; 遗传育种
近10 年来, 现代分子生物学技术迅猛发展, 尤其是PCR方法的建立, 引起了分子生物学发展史上的一场革命, 以PCR 为基础的DNA 指纹技术大大加快了人类研究遗传多样性的步伐, 为不同来源和不同复杂程度基因组的分析提供了有力的工具。AFLP( amplified fragment length ploymorphism)技术是由荷兰Keygene 公司科学家Zabeau 和Vos[1]发展起来的1 种检测DNA 多态性的1 种方法, 1993 年获欧洲专利局专利, 专利权归属荷兰Keygene 公司。该方法是继RFLP( restriction fragment length ploymorphism) , SSR( simple sequencerepeat) 和RAPD( random amplifie ploymorphism DNA) 之后发展最快的DNA 指纹技术, 是DNA 指纹技术的重大突破, 也是目前国际上最新最适用的DNA 指纹技术。AFLP 结合了RFLP 和RAPD 的特点, 既具有RFLP 可靠性好、重复性高的特点, 同时又具有PCR 的高效性、安全性和方便性的优点, 不需要了解基因组信息, 且只需少量纯化的基因组DNA 即可对整个基因组DNA 酶切片段进行选择性扩增, 扩增结果产生大量的序列经电泳形成复杂的DNA 指纹, 得以反映基因组细微的变化, 适合所有生物基因组的检测, 因此被认为是迄今为止最有效最理想的1 种DNA 分子标记技术, 目前已广泛应用于多种植物的遗传育种研究。
1 AFLP 技术的基本原理、流程和技术关键
1.1 AFLP 标记的基本原理
AFLP 技术是基于限制性酶切和PCR 技术的DNA 标记,其基本原理是: 通过对基因组DNA 酶切片段的选择性扩增来检测DNA 酶切片段长度的多态性。首先用2 种限制性内切酶将基因组DNA 切割成带粘性末端的分子量大小不等的限制性片段, 然后将这些片段和与其末端互补的已知序列的双链接头( artificial adapter) 连接, 所形成带接头的特异片段作为PCR 反应的模板。PCR 引物5′端与接头和酶切位点互补, 3′端在酶切位点后增加1～3 个选择性碱基, 使得只有一定比例的限制性片段被选择性地扩增, PCR 产物经变性聚丙烯凝胶电泳分离检测。AFLP 扩增片段的谱带数由内切酶及引物3′端选择碱基的种类、数目和基因组的复杂性决定。
1.2 AFLP 技术流程和关键技术
AFLP 技术流程包括:
(1) 基因组DNA 提取。AFLP 分析要求制备高质量、高纯度、高分子量(HMW) 基因组DNA。制备过程中要特别注意避免核酸酶及各种失活物质污染。对模板浓度要求不高, 在浓度相差1 000 倍的范围内, 得到的结果基本一致。当模板浓度低于一定极限时( 1 pg) , Vos P [2] 得到的图谱同样可靠。
(2) 引物选择。PCR 反应过程中酶切片段扩增效率的差异主要与引物有关而与酶切片段无关, 而引物设计主要取决于接头设计, 变化主要在选择性碱基数目及组合上。引物设计遵循规则: 5′端以G 开始, 可有效防止双链形成; 选择性碱基数目一般为3 个。通过控制实验条件和选择碱基数目可以防止错配带产生。引物由三部分组成: 核心碱基序列( coresequence, CORE) , 该碱基序列与人工接头互补; 特异性酶切序列( enzyme specific sequence, ENZ) ; 引物3′—端选择性碱基( selective extension, EXT) 。选择性碱基延伸到酶切片段区, 这样只有那些两端序列能与选择性碱基配对的限制性酶切片段被扩增。
(3)DNA 酶切及人工接头连接。首先对DNA 要进行充分、彻底的酶切( 否则不能反映真实的多态性) 。然后通过热变性对内切酶进行灭活处理。最后在T4 连接酶作用下与接头连接, 作为扩增反应的模板DNA。
酶切的酶有很多种, 包括EcoRⅠ、TaqⅠ、MspⅠ、HpaⅡ、MseⅠ、PatⅠ等。一般采用双酶切。真核生物中A、T 的丰度较高, MseⅠ的识别序列为TTAA, 比其他内切酶可产生分布均匀的较小片段, 因此MseⅠ是一种多切点酶。EcoRⅠ和其他切点较少的酶, 效果相差不大, 而且EcoRⅠ价格较低, 是一种常用的酶。双酶切可以产生3 种片段: EcoRⅠ- EcoRⅠ、MseⅠ-MseⅠ和EcoRⅠ-MseⅠ。
据中国农业大学肖兴国博士[3]报道, 荷兰科学家VanderWurff 等[4]在AFLP 基础上发展了一种新的DNA 指纹技术, 即TE- AFLP( three endonuclease amplified fragment length polymorphism,三内切酶扩增的限制性片段长度多态性) , 与AFLP 不同的是, 基因组DNA 同时用2 种低频率切点内切酶( 通常为6 碱基位点识别酶) 和1 种高频率切点内切酶( 通常为4 碱基位点识别酶) 混合酶切。
(4) 限制性片段的选择性扩增。首先用核心引物进行预扩增, 然后将预扩增产物稀释10～50 倍后用于选择性扩增。预扩增产物为选择性扩增模板, 同时对模板起选择性纯化的作用, 使谱带更清晰和具更好的重复性。一是可减少“Smear”背景污染; 二是可为AFLP 反应提供大量的模板DNA。
(5) 变性凝胶电泳分析。扩增产物在4%～6% 的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离, 根据标记物质进行相应的检测。根据扩增片段长度的不同检出多态性。
2 AFLP 标记在大白菜遗传育种中的应用
2.1 亲缘关系与遗传多样性分析
采用AFLP 等标记技术, 从分子水平上分析白菜各品种、亚种间的亲缘关系, 为研究白菜类蔬菜起源、演化及分类提供理论依据。孙德岭等[5]用AFLP 选择性引物组合对白菜类蔬菜间亲缘关系的研究结果表明, 芜青与结球白菜和不结球白菜亲缘关系远, 而结球白菜与鸡冠菜和毛白菜亲缘关系较近, 与其他不结球白菜亲缘关系较远。郭晶心等[6]用AFLP 标记进行研究后认为, 芜青和白菜类蔬菜各自单独聚为1 类,在白菜类蔬菜当中, 所有大白菜和薹菜是比较特殊的类群,它们亲缘关系密切, 聚为1 类。小白菜各类型间的相似性程度较低, 说明小白菜的起源较大白菜要早。 2.2 遗传图谱的构建
分子标记连锁图为进行植物基因组的结构分析和比较提供了有力工具。较高密度的分子遗传图谱已有效地应用于数量性状的基因定位、图位克隆基因、比较基因组学研究和分子标记辅助育种等研究中。因此, 对于具有重要经济价值的大白菜来说, 构建1 张高密度的遗传连锁图将具有重大意义。于拴仓等[7]利用杂交获得的102 份F6 代重组自交系, 通过对AFLP 和RAPD 2 种分子标记进行遗传分析, 构建了由352 个遗传标记组成的大白菜连锁图谱。王美等[8]以白菜高抗TuMV 白心株系和高感TuMV 橘红心株系为亲本构建DH 作图群体。通过筛选得到了263 个AFLP 多态性位点, 从而构建了1 张含有255 个标记位点、覆盖长度为883. 7 cM的连锁图。在此基础上, 张立阳等[9]构建了包含10 个连锁群、406个标记位点的分子连锁图谱, 图谱总长度826.3 cM。包括246个AFLP 标记、135 个RAPD 标记、11 个SSR 标记和12个同工酶标记、1 个SCAR 标记和1 个形态标记。除以上性状外, 对雄性不育性[10]、晚抽薹[11]、春化时间[12]等也进行了分子标记的研究, 为这些重要农艺性状的辅助选择奠定了基础。
2.3 特定性状的连锁标记
分子标记技术在白菜抗病育种中也得到了应用。韩国的zhong YP 等[13]将BSA 和AFLP 标记相结合, 对DH 群体分析,找到了与大白菜根瘤病连锁的AFLP 标记, 并对其进行了精细作图。韩和平等[14]以抗病自交系和感病自交系杂交后代的F2 代分离群体为试材, 采用BSA 筛选到2 个与TuMV 感病基因紧密连锁的AFLP 分子标记。根肿病[15]、抗黑腐病[16]等也找到了连锁的标记。郑晓鹰等[17]用同工酶及AFLP 分子标记技术鉴定了大白菜耐热性相关的遗传标记, 为大白菜耐热性分子标记辅助选择提供了理论基础。
2.4 品种纯度鉴定
鉴定品种纯度的常规方法是根据田间表型性状进行鉴定, 即费时又费地, 还影响种子销售, 而生化和分子生物学方法不是不准确就是成本过高, 分子标记方法既快速又简便,成本也不太高, 在幼苗或种子阶段就可鉴定出品种的纯度。AFLP 技术很适合用于种子真实性和品种纯度的鉴定。尤其在鉴定像大白菜这类品种间亲缘关系较近、遗传背景较窄的蔬菜品种上具有更大的优势。张增翠等[18]对不结球白菜优质品种矮抗6 号及其父母本进行了AFLP 标记分析, 筛选出的2 对AFLP 引物组合可明确揭示杂种与父母本之间的遗传关系, 可作为鉴定杂种真伪及纯度的指标。
2.5 QTL 分析
作物的很多重要农艺性状: 如产量性状、品质性状、抗虫性、对不良环境因子的耐性, 一般是由多个基因所控制的数量性状。经典的遗传分析方法只能把控制数量性状的多个基因作为一个整体进行研究, 难以有效地研究控制性状表达的基因数目、基因在染色体上的位置以及基因的效应及其作用方式。卢钢等[19]采用区间作图法对白菜地上部主要农艺性状进行了QTL 分析, 发现与叶形、叶柄形状、株高等8 个重要农艺性状连锁的24 个QTLs 位点, 各性状QTL 的数目在1～5个, 各位点之间存在一定的相关关系。于拴仓等[20]采用复合区间作图的方法, 对大白菜叶球相关的7 个农艺性状进行QTL 定位及遗传效应研究。结果表明, 在14 个连锁群上检测到33 个QTLs, 其中控制生育期的QTL 有3 个, 控制外叶数的QTL 有3 个, 控制球高的QTL 有7 个, 控制球径的QTL 有5 个, 控制球叶数的QTL 有4 个, 控制球重的QTL 有4 个。他们还对白菜的耐热性进行了QTL 分析[21]。采用苗期热害指数进行耐热性表型鉴定, 共检测到8 个耐热性QTLs 位点,分布于3 个连锁群上。发现了与5 个QTL 紧密连锁的侧链分子标记, 它们与QTL 间的距离为0.1～2.4 cM。张俊华等以大白菜抗TuMV- C3 株系的抗病自交系和感病自交系杂交的F2 代单株作为构建遗传图谱的作图群体, 通过EST- PCRRFLP和AFLP 分子标记的遗传分析, 构建了大白菜分子遗传图谱并进行了与大白菜抗TuMV- C3 有关的QTL 分析( 待发表) 。
3 展望
由于对基因微小差异的高度敏感, 以PCR 为基础的AFLP 技术将成为一段时期内最主要的分子工具。尽管AFLP存在成本较高, 对技术要求较苛刻等缺点, 但从近几年发表的有关AFLP 论文数量不断上升的趋势看, AFLP 仍不失为分子生物学研究的有力工具。白菜的分子育种研究取得了显著的成绩, 但与水稻、小麦、玉米等大田作物相比, 无论在研究的广度还是深度上, 仍然有较大的差距。培育抗逆特性显著、品质性状优良、对一些关键病害具有较强抗性的新品种, 是我国育种工作者当前最迫切的任务。今后我国白菜分子标记研究应该围绕以下重点进行, 采用与常规技术结合的方法,构建具有我国特色的白菜核心种质资源, 发掘核心资源的重要园艺性状新基因, 明确其利用价值。针对抗病、优质、抗逆相关基因或QTL 进行标记, 在获得紧密连锁的分子标记的基础上, 建立高通量的分子标记技术平台, 开展大规模的分子标记辅助育种研究; 构建相应的分子标记连锁图谱, 对重要经济性状进行多年多点调查, 获得大量基因型与表型关联数据, 开发利用这些数据进行分子设计育种的计算机软件; 为深入开展大白菜分子设计育种奠定理论基础。
参考文献
[1] Zabeau M, Vos P. Selective triction fragment amplification a generalmethod for DNAfingerprints[M]. European Patent Application Puhl,1993.
[2] Vos P, Hogers R, Bleeker M. AFLP: a newtechnique for DNA fingerprinting[J]. NucleicAcidsResearch, 1995, 23( 21) : 4 407- 4 414.
[3] 肖兴国. 一种经济快速高效的DNA 指纹技术— —TE- AFLP 评价[J]. 农业生物技术学报, 2001, 9( 2) : 202- 204.
[4] Vander Wurff AWG, Chan YL, Van Straaln NM, et al. TE- AFLP:combining rapidity and robustness in DNAfinger printing[J]. NucleicAcids Res, 2000, 28 ( 24) : 5 005- 5 009. [5] 孙德岭, 赵前程, 宋文芹, 等. 白菜类蔬菜亲缘关系的AFLP 分析[J]. 园艺学报, 2001, 28( 4) : 331- 335.
[6] 郭晶心, 周乃儿, 马荣才, 等. 白菜类蔬菜遗传多样性的AFLP分子标记研究[J]. 农业生物技术学报, 2002, 10( 2) : 138- 143.
[7] 于拴仓, 王永健, 郑晓鹰. 大白菜分子遗传图谱的构建与分析[J]. 中国农业科学, 2003, 36( 2) : 190- 195.
[8] 王美, 张凤兰, 孟祥栋, 等. 中国白菜AFLP 分子遗传图谱的构建[J]. 华北农学报, 2004, 19( 1) : 28- 33.
[9] 张立阳, 张凤兰, 王美, 等. 大白菜永久高密度分子遗传图谱的构建[J]. 园艺学报, 2005, 32( 2) : 249- 255.
[10] MiaoY, FelixDreyer, Cai D, et al.Molexular markers for genic malesterility in Chinese cabbage[J]. Euphytica, 2003, 132: 227- 234.
[11] Hidetoshi A, Kuginuki YY, Susumu Y, et al. Klentification andmapping of aquanti trait locus xontrolling extremelate bolting in Chinesecabbage using bulkes segregant analysis [J]. Euphytica, 2001,118: 75- 81.
[12] TeutonicoRA, Osborn TC.Mapping loci controlling vernalization requirementin Brassica rapa [J]. Theor Appl Genet , 1995, 91( 8) :1 279- 1 283.
[13] ZhongYP, Park YJ, Deng YQ, et al. Molecular map of clubroot resistancegene in Chinese cabbage(Brassica rapa ssp. pekinensis) [A].In: Plant