论文部分内容阅读
目的 建立DHPLC技术分析PCa特异性PCA3基因启动子多态性的技术平台.方法 在PCA3基因启动子区域设计1对引物,以本室先前已经建立的11种(C_2T_6、C_2T_5、C_3T_5、C_2T_5/C_2T_6、 C_3T_3/C_3T_4、C_3T_5/C_4T_5、C_3T_5/C_2T_5、C_3T_5/C_2T_6、 C_3T_5/C_1T_8、C_2T_5/C_3T_4、C_2T_6/C_2T_7)已知多态性的PCA3基因启动子的克隆质粒为标准品,通过优化DHPLC检测体系,建立其多态性克隆质粒的标准图谱.采用完全随机设计,从200例病理确诊为PCa患者中选取147例,对其PCA3基因启动子的扩增产物进行DHPLC分析,比较各标本洗脱峰与标准克隆质粒的DHPLC图谱,以判断临床标本PCA3基因多态性类型,并对这些基因型再行克隆测序予以验证.结果 通过克隆质粒优化DHPLC检测体系,最适检测体系为:含44.3%A洗脱液(0.1 mol/L TEAA、0.025%ACN)和55.7%B洗脱液(0.1 mol/L TEAA、25%ACN)的起始洗脱梯度,含35.3%A洗脱液和64.7%B洗脱液的终止洗脱梯度,柱温53℃,流速:0.9 ml/min,在该条件下DHPLC用8种杂合型克隆质粒(C_2T_5/C_2T_6、C_3T_5/C_3T_4、 C_3T_5/C_4T_5、C_3T_5/C_2T_5、C_3T_5/C_2T_6、C_3T_5/C_1T_8、 C_2T_5/C_3T_4、C_2T_6/C_2T_7)进行重复性验证,结果 显示,同一多态性色谱峰中2峰的出峰时间之差的批问CV值在0%～6.67%之间.11种克隆质粒多态性标本仪通过1～2次洗脱,就能根据峰型和各峰的出峰时间将其区分开.147例PCa患者中,144例DHPLC检测结果 和克隆测序结果 一致(Kappa=1,P=0.000),并出现3种新的峰型,经克隆测序验证为3种新的多态性(C_3T_5/C_1T_6、C_2T_5/C_1T_8、C_3T_5/C_2T_7).结论 成功建立的DHPLC分析PCA3基因启动子多态性的技术方法 ,可对PCA3基因启动子多态性进行基因型别鉴定.该方法 具快速、准确、经济、高通量、重复性好、自动化等特点,为进一步研究PCa基因多态性提供了技术平台.