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（1.宁夏颅脑疾病重点实验室，宁夏医科大学，宁夏 银川 750004；2.银川市第一人民医院，宁夏 银川 750004）
摘要：目的：研究氧化苦参碱（OMT）对激活的小胶质细胞的作用及机制。方法：培养BV2小胶质细胞株，实验分为对照组（Con），细菌脂多糖（LPS）组，OMT实验组。应用western-blot检测OMT对LPS激活的BV2细胞HSP60的影响，ELISA检测OMT对HSP60和TNF-α释放的作用。结果：LPS组中HSP60的表达及HSP60、TNF-α的释放都比对照组显著增加，加入OMT后，这些因子的水平都明显降低。结论：OMT可能抑制通过HSP60信号通路降低炎症因子的产生而发挥神经保护作用。
关键词：热休克蛋白60；氧化苦参碱；小胶质细胞
中图分类号：G642.423 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2017）18-0279-02
氧化苦参碱（Oxymatrine，OMT）是中药苦参的提取物。研究证明氧化苦参碱拥有抗炎、抗肿瘤等许多药理学功能[1]，但OMT在中枢神经系统中的作用仍未知。热休克蛋白60（HSP60）是一类应激蛋白，对机体具有保护作用。但研究表明，在病理状态下，细胞内过量表达HSP60，并将其释放到胞外，作为自身免疫因子，导致细胞凋亡[2]。我们前期研究表明枸杞多糖可通过抑制小胶质细胞HSP60的表达及释放而起到神经保护作用[3]。本研究将探讨OMT是否具有相似的神经保护作用。
一、材料与方法
（一）材料
氧化苦参碱和LPS购自Sigma公司；HSP60抗体购自ENZO公司；β-actin抗体购自Cell Signaling公司；BCA试剂盒购自Thermo公司；HSP60和TNF-α ELISA试剂盒购自欣博盛公司。
（二）方法
1.BV2细胞的培养。BV2小胶质细胞株培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中。BV2细胞中加入1μg/ml LPS 30min后，加入20μg/ml的OMT溶液处理24小时后收集细胞总蛋白及上清液。
2.利用Western blot检测HSP60表达。药物处理完毕，提取各组的蛋白并收集上清液，BCA法进行蛋白定量。利用10% SDS-PAGE分离蛋白后转至PVDF膜，用脱脂牛奶在摇床上封闭膜2h。加入一抗，4℃过夜。利用TBST充分洗涤膜后，用二抗室温孵育1h，ECL试剂显色成像。
3.利用ELISA检测HSP60及TNF-α的释放。应用HSP60和TNF-α ELISA试剂盒，依据操作步骤，在酶标仪上450nm处测定各孔光密度值（OD）。
4.统计学分析。采用SPSS11.9进行统计学分析。实验数据用x±s表示，组间比较用方差分析，进一步比较两两间差异采用Student-Neuman-KeulsTest方法。
二、结果
（一）OMT抑制LPS激活后的小胶质细胞中的HSP60的表达及释放
Western blot检测HSP60的表达情况，结果表明与CTRL组相比较，LPS显著增加了HSP60的表达，而OMT能减少HSP60的产生（P<0.05）。ELISA检测细胞外分泌的HSP60的实验表明，LPS增加了HSP60的释放，而OMT能减少细胞外HSP60的释放。
（二）OMT抑制激活的小胶质细胞TNF-α的产生
ELISA结果表明，与对照组相比较，LPS处理后的小胶质细胞TNF-α的释放明显增加，在OMT处理的实验组中，TNF-α的产生显著下降，差别有统计学意义（P<0.05）。
三、讨论
许多神经退行性疾病的发生与小胶质细胞的激活有关，阻止小胶质细胞的激活特别是阻止生成神经毒性因子，可作为治疗神经退行性疾病的方法之一[4]。OMT是中药苦参的一种主要成分，并且拥有多种药理学优点[5]。研究显示在大鼠的大脑局部缺血的模型中，OMT能够减少NF-κB的产生和抑制中枢神经系统中的炎性反应从而减小大脑的损伤[6]。然而OMT的神经保护功能机制尚不明确。本文中，我们研究了OMT的神经保护功能及分子机制。HSP60在心衰病人中被发现可以转位到细胞膜和分泌到细胞外[7]。但是HSP60在中枢神经系统中的作用研究报道还很少。
我们的实验结果发现BV2经LPS激活后，胞内HSP60的表达明显增高，并将其释放至胞外，引起炎症因子TNF-α的产生。而OMT可抑制胞内HSP60的表达，胞外的释放及TNF-α的产生，可能是一种潜在的治疗神经系统炎性疾病的药物。
参考文献：
[1]Yuan XP，Wang YY，Du DR，et al：The effects of the combination of sodium ferulate and oxymatrine on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice [J].Inflammation 35：1161-1168，2012.
[2]Gupta S，Knowlton A A. HSP60，Bax，apoptosis and the heart [R].J Cell Mol Med. 2005，9（1）：51.
[3]Teng P，Li YH，Cheng WJ，Zhou L，Shen Y，Wang Y. Neuroprotective effects of Lycium barbarum polysaccharides in lipopolysaccharide-induced BV2 microglia cells [J].MolecularMedicine Reports，2013，7：1977-1981.
[4]Gonzalez-Scarano F，Baltuch G. Microglia as mediators of inflammatory and degenerative diseases[J].Annu Rev Neurosci，1999；22：219-40.
[5]Huang M，Hu YY，Dong XQ，et al：The protective role of oxymatrine on neuronal cell apoptosis in the hemorrhagic rat brain[J].J Ethnopharmacol 143：228 235，2012.
[6]Liu Y，Zhang XJ，Yang CH：Oxymatrine protectsrat brains against permanent focal ischemia and downregulates NF- kappaB expression. J Brain Res 1268：174-180，2009.
[7]Kim SC，Stice JP，Chen L，Knowlton A A. Extracellular heat shock protein 60，cardiac myocytes，and apoptosis [J].Circ Res，2009；105：1186 1195.
收稿日期：2016-11-30
基金項目：2016年宁夏回族自治区大学生创新创业训练计划项目（NXCX2016122）
作者简介：张燕（1993-），女（汉族），宁夏银川人，宁夏医科大学生物技术专业本科生；李玲（1973-），女（汉族），宁夏银川人，专科，主治医师，银川市第一人民医院高压氧科，主要从事高压氧神经科学研究；王俊燕（1992-），女，宁夏银川人，宁夏医科大学生物技术专业本科生；王银（1973-），女（汉族），宁夏银川人，教授，博士，硕士生导师，宁夏医科大学神经生物学系主任，主要从事神经生物学研究。
通讯作者：李云鸿（1972-），男（汉族），宁夏银川人，副教授，硕士，宁夏医科大学，主要从事神经生物学研究。
摘要：目的：研究氧化苦参碱（OMT）对激活的小胶质细胞的作用及机制。方法：培养BV2小胶质细胞株，实验分为对照组（Con），细菌脂多糖（LPS）组，OMT实验组。应用western-blot检测OMT对LPS激活的BV2细胞HSP60的影响，ELISA检测OMT对HSP60和TNF-α释放的作用。结果：LPS组中HSP60的表达及HSP60、TNF-α的释放都比对照组显著增加，加入OMT后，这些因子的水平都明显降低。结论：OMT可能抑制通过HSP60信号通路降低炎症因子的产生而发挥神经保护作用。
关键词：热休克蛋白60；氧化苦参碱；小胶质细胞
中图分类号：G642.423 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2017）18-0279-02
氧化苦参碱（Oxymatrine，OMT）是中药苦参的提取物。研究证明氧化苦参碱拥有抗炎、抗肿瘤等许多药理学功能[1]，但OMT在中枢神经系统中的作用仍未知。热休克蛋白60（HSP60）是一类应激蛋白，对机体具有保护作用。但研究表明，在病理状态下，细胞内过量表达HSP60，并将其释放到胞外，作为自身免疫因子，导致细胞凋亡[2]。我们前期研究表明枸杞多糖可通过抑制小胶质细胞HSP60的表达及释放而起到神经保护作用[3]。本研究将探讨OMT是否具有相似的神经保护作用。
一、材料与方法
（一）材料
氧化苦参碱和LPS购自Sigma公司；HSP60抗体购自ENZO公司；β-actin抗体购自Cell Signaling公司；BCA试剂盒购自Thermo公司；HSP60和TNF-α ELISA试剂盒购自欣博盛公司。
（二）方法
1.BV2细胞的培养。BV2小胶质细胞株培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中。BV2细胞中加入1μg/ml LPS 30min后，加入20μg/ml的OMT溶液处理24小时后收集细胞总蛋白及上清液。
2.利用Western blot检测HSP60表达。药物处理完毕，提取各组的蛋白并收集上清液，BCA法进行蛋白定量。利用10% SDS-PAGE分离蛋白后转至PVDF膜，用脱脂牛奶在摇床上封闭膜2h。加入一抗，4℃过夜。利用TBST充分洗涤膜后，用二抗室温孵育1h，ECL试剂显色成像。
3.利用ELISA检测HSP60及TNF-α的释放。应用HSP60和TNF-α ELISA试剂盒，依据操作步骤，在酶标仪上450nm处测定各孔光密度值（OD）。
4.统计学分析。采用SPSS11.9进行统计学分析。实验数据用x±s表示，组间比较用方差分析，进一步比较两两间差异采用Student-Neuman-KeulsTest方法。
二、结果
（一）OMT抑制LPS激活后的小胶质细胞中的HSP60的表达及释放
Western blot检测HSP60的表达情况，结果表明与CTRL组相比较，LPS显著增加了HSP60的表达，而OMT能减少HSP60的产生（P<0.05）。ELISA检测细胞外分泌的HSP60的实验表明，LPS增加了HSP60的释放，而OMT能减少细胞外HSP60的释放。
（二）OMT抑制激活的小胶质细胞TNF-α的产生
ELISA结果表明，与对照组相比较，LPS处理后的小胶质细胞TNF-α的释放明显增加，在OMT处理的实验组中，TNF-α的产生显著下降，差别有统计学意义（P<0.05）。
三、讨论
许多神经退行性疾病的发生与小胶质细胞的激活有关，阻止小胶质细胞的激活特别是阻止生成神经毒性因子，可作为治疗神经退行性疾病的方法之一[4]。OMT是中药苦参的一种主要成分，并且拥有多种药理学优点[5]。研究显示在大鼠的大脑局部缺血的模型中，OMT能够减少NF-κB的产生和抑制中枢神经系统中的炎性反应从而减小大脑的损伤[6]。然而OMT的神经保护功能机制尚不明确。本文中，我们研究了OMT的神经保护功能及分子机制。HSP60在心衰病人中被发现可以转位到细胞膜和分泌到细胞外[7]。但是HSP60在中枢神经系统中的作用研究报道还很少。
我们的实验结果发现BV2经LPS激活后，胞内HSP60的表达明显增高，并将其释放至胞外，引起炎症因子TNF-α的产生。而OMT可抑制胞内HSP60的表达，胞外的释放及TNF-α的产生，可能是一种潜在的治疗神经系统炎性疾病的药物。
参考文献：
[1]Yuan XP，Wang YY，Du DR，et al：The effects of the combination of sodium ferulate and oxymatrine on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice [J].Inflammation 35：1161-1168，2012.
[2]Gupta S，Knowlton A A. HSP60，Bax，apoptosis and the heart [R].J Cell Mol Med. 2005，9（1）：51.
[3]Teng P，Li YH，Cheng WJ，Zhou L，Shen Y，Wang Y. Neuroprotective effects of Lycium barbarum polysaccharides in lipopolysaccharide-induced BV2 microglia cells [J].MolecularMedicine Reports，2013，7：1977-1981.
[4]Gonzalez-Scarano F，Baltuch G. Microglia as mediators of inflammatory and degenerative diseases[J].Annu Rev Neurosci，1999；22：219-40.
[5]Huang M，Hu YY，Dong XQ，et al：The protective role of oxymatrine on neuronal cell apoptosis in the hemorrhagic rat brain[J].J Ethnopharmacol 143：228 235，2012.
[6]Liu Y，Zhang XJ，Yang CH：Oxymatrine protectsrat brains against permanent focal ischemia and downregulates NF- kappaB expression. J Brain Res 1268：174-180，2009.
[7]Kim SC，Stice JP，Chen L，Knowlton A A. Extracellular heat shock protein 60，cardiac myocytes，and apoptosis [J].Circ Res，2009；105：1186 1195.
收稿日期：2016-11-30
基金項目：2016年宁夏回族自治区大学生创新创业训练计划项目（NXCX2016122）
作者简介：张燕（1993-），女（汉族），宁夏银川人，宁夏医科大学生物技术专业本科生；李玲（1973-），女（汉族），宁夏银川人，专科，主治医师，银川市第一人民医院高压氧科，主要从事高压氧神经科学研究；王俊燕（1992-），女，宁夏银川人，宁夏医科大学生物技术专业本科生；王银（1973-），女（汉族），宁夏银川人，教授，博士，硕士生导师，宁夏医科大学神经生物学系主任，主要从事神经生物学研究。
通讯作者：李云鸿（1972-），男（汉族），宁夏银川人，副教授，硕士，宁夏医科大学，主要从事神经生物学研究。