论文部分内容阅读
摘要：为了更加准确地掌握病原菌耐药性变化规律，合理指导养殖生产精准用药，减少抗菌药物滥用，避免病原菌产生耐药性，同时提高治疗效果，减少生产成本，确保水产品质量安全，北京市水产技术推广站2015年通过非定点和定点两种方式对北京市养殖鱼类开展了精准用药监测工作。全年非定点监测40余个渔场，对55个样品进行了分析；分离病原菌以嗜水气单胞菌和温和气单胞菌为主；采用K-B法检测的病原菌药物敏感性显示：病原菌对氟喹诺酮类药物（奥复星、左氧氟沙星、诺氟沙星和恩诺沙星）的敏感率较高，普遍在9074%以上；酰胺醇类（氟苯尼考）次之，为85.19%；四环素类（四环素、强力霉素）分别为75.93%和72.22%；两种磺胺类药物（磺胺异恶唑和甲氧苄啶）较低，分别为14.81%和24.07%。全年定点监测冷水鱼（虹鳟）和观赏鱼（金鱼）各2个渔场，分离60株气单胞菌；监测结果显示，北京市虹鳟鱼源和金鱼源的气单胞菌对磺胺类药物耐药最为严重，耐药率均在90%以上，耐药浓度在512 μmg/mL以上，其次是氟苯尼考和甲砜霉素，耐药率约为30%，而乳酸诺氟沙星、烟酸诺氟沙星和盐酸多西环素，耐药率分别为3.3%、1.7%和1.7%。
关键词：北京市；养殖鱼类；精准用药；监测
2015年北京市水产技术推广站通过组织开展的养殖鱼类精准用药监测工作，初步了解掌握了北京市养殖鱼类病原菌组成及其耐药性变化规律，为科学防治鱼病提供参考。
1监测方式
1.1非定点监测
4-10月，根据养殖户的需求，我站技术人员亲自到渔场进行现场鱼病诊断，了解养殖场基本信息，询问发病、死亡及用药情况等信息。现场进行水质测定、寄生虫检测和无菌操作进行病原菌分离，然后将待测样品带回实验室，进行培养、鉴定及敏感药物筛选 。2～3 d筛选出敏感药物及时告知养殖户，防止药物滥用，提高治疗有效率。并定期回访养殖户，跟踪调查用药效果。
1.2定点监测
为了更加准确地掌握病原菌耐药性变化规律，2015年北京市水产技术推广站根据北京市水产养殖特色，分别在怀柔区和通州区设置冷水鱼（虹鳟鱼）和观赏鱼（金鱼）采样点。虹鳟鱼采样点为北京顺通虹鳟鱼养殖中心和北京卧佛山庄养殖有限公司；金鱼采样点为通州区台湖镇唐大庄村的2家金鱼养殖场。4月至10月，每月采样1次。取池塘中患病或不健康的鱼，一般不少于6尾，和原池水装入高压聚乙烯袋，加冰块，立即运回实验室。实验室内进行病原菌分离。采样现场记录渔场的发病、死亡及用药情况等信息。
2病原菌的分离、鉴定与保存
对温水性鱼类（鲤、草、鲫、金鱼等）病鱼样品，无菌操作直接取肝、肾划线于脑心浸液琼脂（BHIA）上，28 ℃培养24～48 h，取优势菌落进行纯化。对冷水性鱼类（虹鳟等）样品，无菌操作取肝、肾组织块，首先接种于脑心浸液肉汤（BHI），然后在BHIA上划线分离。前者22 ℃增菌24～48 h，然后采用RS琼脂划线分离，选择黄色、圆形、微凸且有芳香性气味的菌落进行纯化。后者于22 ℃培养72 h，若出现产褐色素的菌落，则分离纯化。
经纯化的菌落采用API鉴定系统或者结合PCR 扩增16S rDNA基因进行鉴定，最后于-80 ℃保存。
3病原菌的抗菌药物感受性检测
3.1针对非定点监测分离病原菌对抗菌药物只进行定性分析
由于非定点监测区均为临时发病场，且急需用药进行治疗。因此我们针对非定点监测区分离病原菌对抗菌药物只进行定性分析，即采用纸片扩散法（K-B法）（表1），将敏感药物及时反馈养殖户，进行及时治疗。
表1纸片扩散法使用抗菌药物及界定的敏感线
药物类别药物种类简称药敏纸片浓度
（μg/片）判断标准/mm耐药中介敏感备注磺胺类四环素酰胺醇类氟喹诺酮类磺胺甲恶唑磺300≤1213～16≥17国标渔药甲氧苄啶T 5≤1011～15≥16国标渔药四环素四30≤1415～18≥19渔药手册强力霉素强30≤1213～15≥16国标渔药氟苯尼考尼75≤1213～17≥18国标渔药奥复星奥5≤1213～15≥16渔药手册左氟沙星左5≤1314～16≥17渔药手册氟哌酸氟10≤1213～16≥17国标渔药恩诺沙星嗯5≤1617～19≥20国标渔药
3.2针对定点监测区分离病原菌对抗菌药物集中进行定量分析
采用最小抑菌浓度（MIC）法对分离病原菌对我国现在允许使用的水产用抗菌类药物进行耐受性分析，结合分离渔场用药情况，分析出不同病原菌对不同抗菌药物的感受性，以便更合理地选择抗菌药物种类，包括硫酸新霉素、盐酸多西环素、氟苯尼考、甲砜霉素、烟酸诺氟沙星、乳酸诺氟沙星、磺胺嘧啶钠、磺胺二甲氧嘧啶钠、新诺明。
4监测结果
4.1非定点监测结果
4-10月，我站在通州、平谷、顺义、怀柔、昌平、密云等区县的40余个渔场进行了鱼病诊疗工作，对55个样品进行了病原菌分离及敏感药物筛选。涉及品种有草鱼、鲤鱼、观赏鱼（金鱼、锦鲤）、虹鳟和鲟鱼等。
4.1.1病原菌分离情况2015年 4月至10月，根据疾病流行季节和水温等情况每隔10～15 d监测1次。累计采集16次、55个样品。其中草鱼22个、鲤8个、鲫2个、青鱼1个、泥鳅1个，金鱼样品12个、锦鲤9个。共分离病原菌17种54株，其中2株未鉴定出。分离菌中嗜水气单胞菌21株、温和气单胞菌15株，分别占总分离株的38.89%和27.78%，分离自草鱼、鲤、鲫、锦鲤和草金鱼；其次为类志贺邻单胞菌、泛菌属和产碱假单胞菌，分离自草鱼和锦鲤。
4.1.2病原菌药物敏感性总体分析采用K-B法检测的病原菌药物敏感性结果：总体上，氟喹诺酮类药物（奥复星、左氧氟沙星、诺氟沙星和恩诺沙星）对病原菌的敏感率较高，普遍在90.74%以上；酰胺醇类（氟苯尼考）对病原菌的敏感率次之，为85.19%；四环素类（四环素、强力霉素）对病原菌的敏感率分别为75.93%和72.22%；两种磺胺类药物（磺胺异恶唑和甲氧苄啶）对病原菌的敏感率较低，分别为14.81%和24.07%。 4.2定点监测结果
4.2.1病原菌的分离4-10月，在4个监测点共采集样品18次。分离气单胞菌60株，其中嗜水气单胞菌22株（虹鳟鱼源8株、金鱼源14株）、温和气单胞菌30株（虹鳟鱼源9株、金鱼源21株）、杀鲑气单胞菌8株（来自虹鳟鱼）。本次监测主要对气单胞菌属的细菌进行了耐药性分析。
4.2.2分离60株气单胞菌对9种抗菌药物的耐药性总体情况监测结果显示，北京市虹鳟鱼源和金鱼源的气单胞菌对磺胺类药物耐药最为严重，耐药率均在90%以上，耐药浓度在512 μg/mL以上；其次是氟苯尼考和甲砜霉素，耐药率约为30%。耐药率低于5%的药物种类为乳酸诺氟沙星、盐酸诺氟沙星和盐酸多西环素，耐药率分别为3.3%、1.7%和1.7%。
4.2.3不同气单胞菌种类对抗菌药物的耐药性分析监测结果显示，共分离嗜水气单胞菌（A.H）22株、温和气单胞菌（A.S）30株和杀鲑气单胞菌（A.S.S）8株。气单胞菌对磺胺类药物的耐药率和加权平均MIC值，A.H>A.S>A.S.S；对氟苯尼考和甲砜霉素的耐药率和加权平均MIC值，A.S.S>A.H>A.S；对盐酸多西环素的耐药率，A.S>A.H=A.S.S，对盐酸多西环素的加权平均MIC，A.H>A.S.S>A.S。对硫酸新霉素的耐药率和加权平均MIC值，A.S>A.H>A.S.S；对乳酸诺氟沙星和盐酸诺氟沙星的耐药率，A.H>A.S.S=A.S，对乳酸诺氟沙星和盐酸诺氟沙星的加权平均MIC值，A.S.S>A.H>A.S，见表3。
5分析与建议
北京市养殖鱼类分离病原菌均对磺胺类药物呈现较高的耐受率，均在90%以上；建议养殖户停止该药的使用；对酰胺醇类（氟苯尼考）的敏感率次之；而对氟喹诺酮类药物（诺氟沙星、恩诺沙星）和四环素类（盐酸多西环素）敏感率较高。因此，在生产中可以首选敏感率高的抗菌药物，但由于不同养殖场、不同鱼类、不同病原菌种类、甚至同种病原菌的不同菌株对抗菌药物的感受性不同。所以，建议还是要依据检测结果指导养殖者合理使用抗菌药物。
另外，本文采用的两种氟喹诺酮类药物中的乳酸诺氟沙星和烟酸诺氟沙星已经于2016年1月1日起禁止用于养殖生产，届时可采用该类药物中的恩诺沙星。
氟苯尼考在使用过程中，容易使病原菌短时间产生较高的耐药性，且其耐药性消失速率较慢。因此，建议使用该药时需要一次给足剂量，且再次使用时需增加用药间隔。
关键词：北京市；养殖鱼类；精准用药；监测
2015年北京市水产技术推广站通过组织开展的养殖鱼类精准用药监测工作，初步了解掌握了北京市养殖鱼类病原菌组成及其耐药性变化规律，为科学防治鱼病提供参考。
1监测方式
1.1非定点监测
4-10月，根据养殖户的需求，我站技术人员亲自到渔场进行现场鱼病诊断，了解养殖场基本信息，询问发病、死亡及用药情况等信息。现场进行水质测定、寄生虫检测和无菌操作进行病原菌分离，然后将待测样品带回实验室，进行培养、鉴定及敏感药物筛选 。2～3 d筛选出敏感药物及时告知养殖户，防止药物滥用，提高治疗有效率。并定期回访养殖户，跟踪调查用药效果。
1.2定点监测
为了更加准确地掌握病原菌耐药性变化规律，2015年北京市水产技术推广站根据北京市水产养殖特色，分别在怀柔区和通州区设置冷水鱼（虹鳟鱼）和观赏鱼（金鱼）采样点。虹鳟鱼采样点为北京顺通虹鳟鱼养殖中心和北京卧佛山庄养殖有限公司；金鱼采样点为通州区台湖镇唐大庄村的2家金鱼养殖场。4月至10月，每月采样1次。取池塘中患病或不健康的鱼，一般不少于6尾，和原池水装入高压聚乙烯袋，加冰块，立即运回实验室。实验室内进行病原菌分离。采样现场记录渔场的发病、死亡及用药情况等信息。
2病原菌的分离、鉴定与保存
对温水性鱼类（鲤、草、鲫、金鱼等）病鱼样品，无菌操作直接取肝、肾划线于脑心浸液琼脂（BHIA）上，28 ℃培养24～48 h，取优势菌落进行纯化。对冷水性鱼类（虹鳟等）样品，无菌操作取肝、肾组织块，首先接种于脑心浸液肉汤（BHI），然后在BHIA上划线分离。前者22 ℃增菌24～48 h，然后采用RS琼脂划线分离，选择黄色、圆形、微凸且有芳香性气味的菌落进行纯化。后者于22 ℃培养72 h，若出现产褐色素的菌落，则分离纯化。
经纯化的菌落采用API鉴定系统或者结合PCR 扩增16S rDNA基因进行鉴定，最后于-80 ℃保存。
3病原菌的抗菌药物感受性检测
3.1针对非定点监测分离病原菌对抗菌药物只进行定性分析
由于非定点监测区均为临时发病场，且急需用药进行治疗。因此我们针对非定点监测区分离病原菌对抗菌药物只进行定性分析，即采用纸片扩散法（K-B法）（表1），将敏感药物及时反馈养殖户，进行及时治疗。
表1纸片扩散法使用抗菌药物及界定的敏感线
药物类别药物种类简称药敏纸片浓度
（μg/片）判断标准/mm耐药中介敏感备注磺胺类四环素酰胺醇类氟喹诺酮类磺胺甲恶唑磺300≤1213～16≥17国标渔药甲氧苄啶T 5≤1011～15≥16国标渔药四环素四30≤1415～18≥19渔药手册强力霉素强30≤1213～15≥16国标渔药氟苯尼考尼75≤1213～17≥18国标渔药奥复星奥5≤1213～15≥16渔药手册左氟沙星左5≤1314～16≥17渔药手册氟哌酸氟10≤1213～16≥17国标渔药恩诺沙星嗯5≤1617～19≥20国标渔药
3.2针对定点监测区分离病原菌对抗菌药物集中进行定量分析
采用最小抑菌浓度（MIC）法对分离病原菌对我国现在允许使用的水产用抗菌类药物进行耐受性分析，结合分离渔场用药情况，分析出不同病原菌对不同抗菌药物的感受性，以便更合理地选择抗菌药物种类，包括硫酸新霉素、盐酸多西环素、氟苯尼考、甲砜霉素、烟酸诺氟沙星、乳酸诺氟沙星、磺胺嘧啶钠、磺胺二甲氧嘧啶钠、新诺明。
4监测结果
4.1非定点监测结果
4-10月，我站在通州、平谷、顺义、怀柔、昌平、密云等区县的40余个渔场进行了鱼病诊疗工作，对55个样品进行了病原菌分离及敏感药物筛选。涉及品种有草鱼、鲤鱼、观赏鱼（金鱼、锦鲤）、虹鳟和鲟鱼等。
4.1.1病原菌分离情况2015年 4月至10月，根据疾病流行季节和水温等情况每隔10～15 d监测1次。累计采集16次、55个样品。其中草鱼22个、鲤8个、鲫2个、青鱼1个、泥鳅1个，金鱼样品12个、锦鲤9个。共分离病原菌17种54株，其中2株未鉴定出。分离菌中嗜水气单胞菌21株、温和气单胞菌15株，分别占总分离株的38.89%和27.78%，分离自草鱼、鲤、鲫、锦鲤和草金鱼；其次为类志贺邻单胞菌、泛菌属和产碱假单胞菌，分离自草鱼和锦鲤。
4.1.2病原菌药物敏感性总体分析采用K-B法检测的病原菌药物敏感性结果：总体上，氟喹诺酮类药物（奥复星、左氧氟沙星、诺氟沙星和恩诺沙星）对病原菌的敏感率较高，普遍在90.74%以上；酰胺醇类（氟苯尼考）对病原菌的敏感率次之，为85.19%；四环素类（四环素、强力霉素）对病原菌的敏感率分别为75.93%和72.22%；两种磺胺类药物（磺胺异恶唑和甲氧苄啶）对病原菌的敏感率较低，分别为14.81%和24.07%。 4.2定点监测结果
4.2.1病原菌的分离4-10月，在4个监测点共采集样品18次。分离气单胞菌60株，其中嗜水气单胞菌22株（虹鳟鱼源8株、金鱼源14株）、温和气单胞菌30株（虹鳟鱼源9株、金鱼源21株）、杀鲑气单胞菌8株（来自虹鳟鱼）。本次监测主要对气单胞菌属的细菌进行了耐药性分析。
4.2.2分离60株气单胞菌对9种抗菌药物的耐药性总体情况监测结果显示，北京市虹鳟鱼源和金鱼源的气单胞菌对磺胺类药物耐药最为严重，耐药率均在90%以上，耐药浓度在512 μg/mL以上；其次是氟苯尼考和甲砜霉素，耐药率约为30%。耐药率低于5%的药物种类为乳酸诺氟沙星、盐酸诺氟沙星和盐酸多西环素，耐药率分别为3.3%、1.7%和1.7%。
4.2.3不同气单胞菌种类对抗菌药物的耐药性分析监测结果显示，共分离嗜水气单胞菌（A.H）22株、温和气单胞菌（A.S）30株和杀鲑气单胞菌（A.S.S）8株。气单胞菌对磺胺类药物的耐药率和加权平均MIC值，A.H>A.S>A.S.S；对氟苯尼考和甲砜霉素的耐药率和加权平均MIC值，A.S.S>A.H>A.S；对盐酸多西环素的耐药率，A.S>A.H=A.S.S，对盐酸多西环素的加权平均MIC，A.H>A.S.S>A.S。对硫酸新霉素的耐药率和加权平均MIC值，A.S>A.H>A.S.S；对乳酸诺氟沙星和盐酸诺氟沙星的耐药率，A.H>A.S.S=A.S，对乳酸诺氟沙星和盐酸诺氟沙星的加权平均MIC值，A.S.S>A.H>A.S，见表3。
5分析与建议
北京市养殖鱼类分离病原菌均对磺胺类药物呈现较高的耐受率，均在90%以上；建议养殖户停止该药的使用；对酰胺醇类（氟苯尼考）的敏感率次之；而对氟喹诺酮类药物（诺氟沙星、恩诺沙星）和四环素类（盐酸多西环素）敏感率较高。因此，在生产中可以首选敏感率高的抗菌药物，但由于不同养殖场、不同鱼类、不同病原菌种类、甚至同种病原菌的不同菌株对抗菌药物的感受性不同。所以，建议还是要依据检测结果指导养殖者合理使用抗菌药物。
另外，本文采用的两种氟喹诺酮类药物中的乳酸诺氟沙星和烟酸诺氟沙星已经于2016年1月1日起禁止用于养殖生产，届时可采用该类药物中的恩诺沙星。
氟苯尼考在使用过程中，容易使病原菌短时间产生较高的耐药性，且其耐药性消失速率较慢。因此，建议使用该药时需要一次给足剂量，且再次使用时需增加用药间隔。