【摘 要】
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目的获得牛冠状病毒N基因的全长序列,实现N基因在大肠杆菌中的高效表达,并进行初步应用。方法根据已发表的牛冠状病毒Mebus株的序列设计引物,对BCV-DQ株进行RT-PCR扩增、克隆
【基金项目】
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黑龙江农垦总局攻关课题(HNKXIV-08-07)
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目的获得牛冠状病毒N基因的全长序列,实现N基因在大肠杆菌中的高效表达,并进行初步应用。方法根据已发表的牛冠状病毒Mebus株的序列设计引物,对BCV-DQ株进行RT-PCR扩增、克隆和测序;将该基因插入到原核表达载体pET-30a(+)上进行原核表达,SDS-PAGE和Western blot检测;用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,建立ELISA检测方法,对部分临床样本进行检测。结果BCV-DQ株N基因全长1347bp,与GenBank已发表的6株BCV的N基因相比较,核苷酸同源性98.3%以上。构建的重组质粒pET-N能表达出一条大小约为60ku的蛋白,且能与鼠抗BCV血清发生特异性反应。用建立的ELISA方法对黑龙江不同地区送检的共256份牛血清样品进行检测,结果阳性率65.23%,与病毒中和试验的符合率达95.31%。结论BCV N基因保守性很高,并在原核表达系统中获得了高效表达,其表达产物具有良好的免疫反应原性。临床检测结果表明N蛋白可作为诊断抗原用于牛冠状病毒病的流行病学调查。
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