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中图分类号 R575；Q23 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）23-3203-05
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.08
摘 要 目的：探讨α-苦瓜素诱导肝细胞L02（简称“L02细胞”）早期凋亡的信号通路。方法：制备并纯化α-苦瓜素。采用流式细胞术检测0（阴性对照）、160、80 μg/mL α-苦瓜素作用L02细胞2～8 h后的细胞凋亡率。小干扰RNA（siRNA）沉默低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）得到LRP1-siRNA细胞，然后采用液相芯片分析术检测α-苦瓜素（160 μg/mL）分别作用L02细胞（正常组）和LRP1-siRNA细胞（沉默组）0、0.25、0.5、1、2 h后c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路中促调蛋白磷酸化JNK（p-JNK）、磷酸化凋亡前体蛋白（p-Bad）、胱天蛋白酶9（Caspase-9）及抑调蛋白磷酸化蛋白53（p-p53）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、磷酸化B淋巴细胞瘤2（p-Bcl-2）、Caspase-8的表达情况，分析α-苦瓜素对L02细胞JNK信号通路的作用。结果：制备并纯化得到α-苦瓜素（纯度>97%）；与阴性对照组比较，160 μg/mL α-苦瓜素作用8 h时，可显著诱导细胞早期凋亡（P<0.05），80 μg/mL α-苦瓜素诱导的早期凋亡不明显（P>0.05）；与0 h比较，作用后0.25 h促调蛋白p-JNK、p-Bad和Caspase-9表达量显著增加（P<0.05），而抑调蛋白p-p53、p-Akt、p-Bcl-2和Caspase-8表達量无变化；与正常组相比，沉默组各时间点的p-JNK、p-Bad和Caspase-9的表达均显著减少（P<0.05）。结论：α-苦瓜素可能通过LRP1受体介导JNK信号通路诱导肝细胞凋亡，为揭示其肝毒性提供了参考。
关键词 α-苦瓜素；凋亡；肝细胞L02；c-Jun氨基末端激酶信号通路；低密度脂蛋白受体相关蛋白1
ABSTRACT OBJECTIVE： To explore the signaling pathway of α-momordicin inducing early apoptosis of hepatocyte L02 （called “the L02 cell” for short）. METHODS： α-momordicin was prepared and purified. Flow cytometry was used to detect the apoptotic rate of the L02 cell after treated with 0 （negative control）， 160 and 80 μg/mL of α-momordicin for 2-8 h. LRP1-siRNA cells were obtained by small interfering RNA （siRNA） silencing low density lipoprotein receptor-related protein 1 （LRP1）. The expression of proapoptotic protein p-JNK， p-Bad， Caspase-9， inhibitor of apoptosis protein p-p53， p-Akt，p-Bcl-2 and active Caspase-8 in the L02 cell （normal group） and LRP1-siRNA （silence group） after treated with α-momordicin for 0， 0.25， 0.5， 1， 2 h were determined by liquid biochip analysis in c-Jun N-terminal kinase （JNK） signaling pathway. Effects of α-momordicin on JNK signaling pathway were analyzed. RESULTS： α-momordicin could be prepared and purified （purity>97%）. Compared with negative control group， 160 μg/mL α-momordicin could significantly induced early apoptosis of the cell after treated for 8 h （P<0.05）； early apoptosis of the cell induced by 80 μg/mL α-momordicin was not obvious （P>0.05）. Compared with 0 h， the expression of p-JNK， p-Bad and Caspase-9 were increased significantly and even reached the peak value 0.25 h after medication （P<0.05）， while the expression of p-p53， p-Akt， p-Bcl-2 and Caspase-8 had no change. Compared with normal group， the expression of p-JNK， p-Bad and Caspase-9 of silence group were decreased significantly at different time points （P<0.05）. CONCLUSIONS： α-momordicin can induce the apoptosis of hepatocytes via LRP1 receptor mediated JNK signaling pathway， and will provide the reference for its hepatotoxicity. KEYWORDS α-momordicin； Apoptosis； Hepatocyte L02； c-Jun N-terminal kinase signaling pathway； Low density lipoprotein receptor-related protein 1
α-苦瓜素是从苦瓜种子中提取的Ⅰ型核糖体失活蛋白（Ribosome-inactivating proteins，RIPs），具有抗肿瘤、抗病毒等多种药理学作用[1-2]。据相关研究报道，α-苦瓜素通过激活凋亡信号通路胱天蛋白酶3（Caspase-3），诱导乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞凋亡[3]。本课题组在前期试验中发现，α-苦瓜素虽能显著抑制MCF-7细胞移植瘤的增殖，但也能引起动物肝功能的异常和肝细胞的坏死[4-5]，使得其临床应用受到阻碍。
目前有研究发现，同为Ⅰ型RIPs的天花粉蛋白（TCS）能通过低密度脂蛋白受体相关蛋白1 （LRP 1）受体介导进入肿瘤细胞[6-7]。LRP1既是一种内吞型受体，同时也具有信号转导的功能，能激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）/促丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号转导途径调节细胞增殖和凋亡[8]。由于LRP1在肝细胞上分布极为丰富[9]，故笔者推测，α-苦瓜素可能通过该信号转导通路诱导肝细胞凋亡。
本研究以正常人胚肝细胞L02（简称“L02细胞”）为试验对象，以流式细胞术分析α-苦瓜素诱导的肝细胞凋亡，以液相芯片分析技術检测α-苦瓜素作用后，JNK信号通路凋亡信号蛋白中促调蛋白JNK、凋亡前体蛋白（Bad）、Caspase-9和抑调蛋白蛋白53（p53）、蛋白激酶B（Akt）、B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）、Caspase-8的表达水平变化，并以LRP1基因敲降法[10]验证该信号通路的LRP1 受体介导作用，从而阐明α-苦瓜素诱导细胞凋亡的发生途径，为揭示α-苦瓜素诱导的肝脏毒性发生机制提供参考。
1 材料
1.1 仪器
BX51倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；Accuri 6流式细胞仪（美国BD公司）； 76S/02324凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；Luminex 200液相芯片检测分析系统（美国Millipore公司）；AKTA蛋白质纯化系统（美国GE公司）；UltrafleⅩⅢ飞行时间质谱仪、MaXis电喷雾四级杆飞行时间质谱仪（美国Bruker 公司）。
1.2 药品与试剂
苦瓜种子（四川省农科院种子公司，批号：20160912）；Annexin Ⅴ-FITC凋亡试剂盒（美国BioVision公司，批号：K201-100）；RPMI-1640培养基（美国Gibco公司，批号：C11875500BT）；胎牛血清（美国HyClone公司，批号：NUCO53）；兔抗人LRP1抗体（美国Abcam公司，批号：AB7975）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（美国R&D公司，批号：HY90077）；β-肌动蛋白（β-actin）抗体（美国Novus公司）；人早凋信号蛋白检测试剂盒（内含Akt、JNK、Bad、Bcl-2、p53磷酸化抗体和Caspase-8、Caspase-9抗体，美国Millipore公司，批号：48-669MAG）；LRP1小干扰RNA（siRNA）试剂盒[内含A、B、C 3种序列siRNA和非特异性siRNA，3种序列siRNA分别为LRP1-siRNA-A（5′ -ACACCAAUAAGAAG- CAGAUCAAUGT-3′ ）、LRP1-siRNA-B（5′ -AGAUUUGUCCACAGAGUAAGGCCCA-3′ ）、LRP1-siRNA-C（5′ - GGCUGUGACUGACGAGGAACCGUTT-3′ ）]、Trans1.0转染试剂均购自美国Origene公司；细胞裂解液RIPA、蛋白酶抑制剂均购自美国Millipore公司。
1.3 细胞
人胚肝细胞L02购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
2 方法
2.1 α-苦瓜素的制备及纯化鉴定
将苦瓜种子研磨成粉末并用50 mmol/L醋酸盐缓冲溶液（pH=6.3）萃取，得到α-苦瓜素粗提样品；在2 ℃条件下向粗提物中加入250 mmol/L HCl增溶，1 000 r/min离心后，取上清液用1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.0）中和，再用硫酸铵沉淀蛋白，得硫酸铵沉淀蛋白样品；再分别经SP-琼脂糖凝胶色谱、离子交换层析、凝胶过滤色谱纯化后，得到α-苦瓜素蛋白纯品。分别对上述纯化过程收获的中间样品（硫酸铵沉淀蛋白样品、SP-琼脂糖凝胶色谱洗脱样品、离子交换层析样品）以及纯化后α-苦瓜素蛋白纯品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并对纯化后α-苦瓜素蛋白纯品进行高效液相色谱（HPLC）纯度测定和飞行时间质谱分子量分析以及电喷雾四极杆质谱N-末端氨基酸序列分析。
2.2 细胞培养
肝细胞L02采用含有10%胎牛血清、100 u/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基，于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。
2.3 α-苦瓜素诱导的细胞凋亡检测
按1×105个/孔将L02细胞接种在6孔板中，待细胞贴壁达50%～60%融合度时，分别加入终质量浓度为0（阴性对照）、80、160 μg/mL的α-苦瓜素，并于给药2、4、8 h后消化并重悬各孔细胞，加入5 μL Annexin Ⅴ和10 μL碘化丙啶（PI），用流式细胞仪检测细胞凋亡率，以FlowJo 10软件分析凋亡细胞的分布情况。
2.4 LRP1-siRNA转染细胞 将L02细胞接种于6孔板中，设置LRP1-siRNA-A组、LRP1-siRNA-B组、LRP1-siRNA-C组、非特异性siRNA组和阴性对照组（PBS）。当细胞生长融合度达到30～40%时，分别向各组培养基中加入4 μL 5 mmol/L的LRP1-siRNA（A、B、C 3种）、非特异性siRNA和PBS，然后加入20 μL Trans1.0转染试剂。转染4 h后，将培养液更换为含有双抗体（青霉素-链霉素）的10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，继续培养72 h。
2.5 Western blot法检测LRP1-siRNA沉默作用
采用Western blot检测siRNA基因的沉默效果。裂解“2.4”项各组细胞，提取蛋白，经SDS-PAGE分离、转膜、封闭、分别加入一抗兔抗人LRP1抗体（1 ∶ 20 000），过夜冷藏，TBST缓冲液洗膜，分别加入二抗HRP-羊抗兔IgG（1 ∶ 1 000），37 ℃孵育1 h，TBST缓冲液洗膜，采用化学发光法检测成像结果，β-actin作为内参对照，筛选出使LRP1蛋白缺失85%以上的阳性LRP1-siRNA用于后续试验。
2.6 液相芯片法检测α-苦瓜素对凋亡信号蛋白的影响
2.6.1 分组及给药 （1）正常组。将对数生长期的L02细胞接种于6孔板中，融合度60%时加入终质量浓度为160 ?g/mL的α-苦瓜素，分别于作用0、0.25、0.5、1、2 h后以RIPA裂解细胞并收集细胞裂解液样品，4 ℃下10 000 r/min离心，收集各上清液。（2）LRP1-siRNA沉默组。以“2.5”项筛选的阳性LRP1-siRNA转染L02细胞，培养72 h后，同上述方法给药处理，并收集各上清液。经BCA法测定如上所有上清样品的蛋白含量，并调整蛋白质量浓度至0.4 mg/mL，-80 ℃保存。
2.6.2 凋亡信号蛋白的检测 采用液相芯片分析系统检测各组细胞在α-苦瓜素（160 ?g/mL）作用0～2 h后磷酸化JNK （p-JNK）、磷酸化Bad（p-Bad）、Caspase-9、磷酸化p53（p-p53）、磷酸化Akt（p-Akt）、磷酸化Bcl-2（p-Bcl- 2）、Caspase-8的表达水平，具体试验操作严格参考人早凋信号蛋白检测试剂盒说明书，以检测的各组细胞目标蛋白的荧光强度（MFI值）反映其表达水平。将检测到的各组细胞中p-JNK、p-Bad、Caspase-9、p-p53、p-Akt、p-Bcl-2、Caspase-8的MFI值作为纵坐标，α-苦瓜素作用时间为横坐标，绘制荧光强度-时间曲线图。
2.7 统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 α-苦瓜素蛋白的纯化鉴定结果
纯化得到α-苦瓜素蛋白纯品，经HPLC色谱分析纯度大于97%；飞行时间质谱分析得出α-苦瓜素蛋白样品分子量为28 551.6 Da，电喷雾四极杆质谱分析得出该蛋白样品N-末端5个氨基酸序列N-天冬氨酸-缬氨酸-丝氨酸-苯丙氨酸-精氨酸，经查询，与NCBI公布的α-苦瓜素序列一致（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），表明纯化得到的蛋白样品即为α-苦瓜素蛋白。α-苦瓜素纯化过程及最终蛋白纯品的SDS-PAGE电泳结果见图1。
3.2 α-苦瓜素诱导L02细胞早期凋亡结果
流式细胞仪检测结果显示，α-苦瓜素质量浓度为160 μg/mL时，诱导L02细胞的细胞凋亡率分别为2.8%（2 h）、3.8%（4 h）和6.2%（8 h），α-苦瓜素質量浓度为80 μg/mL时，诱导L02细胞的细胞凋亡率分别为2.6%（2 h）、3.4%（4 h）和3.8%（8 h）。与阴性对照组比较，160 μg/mL（8 h）的细胞凋亡率显著升高（P<0.05），80 μg/mL各时段的细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。α-苦瓜素诱导L02细胞凋亡的检测结果如图2。
3.3 Western blot检测LRP1-siRNA的基因沉默结果
检测结果显示，L02细胞的LRP1受体经siRNA法基因沉默72 h后，LRP1-siRNA-C组蛋白条带缺失在85%以上，表现出了良好的沉默效果。L02细胞LRP1- siRNA沉默效果的蛋白电泳图见图3。
3.4 α-苦瓜素对L02细胞凋亡信号蛋白表达的影响结果
各组细胞中p-JNK、p-Bad、Caspase-9、p-p53、p-Akt、p-Bcl-2、Caspase-8荧光强度-时间曲线图见图4。
由图4可知，正常组于给药0.25 h时各促调蛋白p-JNK，p-Bad和活化Caspase-9表达达到高峰，直至给药2 h时依然处于较高水平，且与0 h比较有显著差异（P<0.05）；各抑调蛋白p-p53、p-Akt、p-Bcl-2、活化Caspase-8各时段表达无显著变化。与正常组比较，LRP1-siRNA沉默组各时段促调蛋白表达明显抑制（P<0.05），而抑凋蛋白的表达无显著变化。表明LRP1受体的基因沉默可以显著阻止α-苦瓜素对L02细胞的凋亡信号转导作用。
4 讨论
苦瓜入药在《本草纲目》《滇南本草》中早有记载[11]，从苦瓜种子中提取的α-苦瓜素具有抗肿瘤、抗病毒等作用，是一种药用价值较高的天然药物[1-2]。研究发现，α-苦瓜素属于RIPS，同天花粉蛋白一样，被证实对乳腺癌、绒毛膜细胞癌、黑色素瘤等皆有较强的抗肿瘤活性，已成为肿瘤治疗的候选药物之一[12-13]。在本课题组前期抗肿瘤试验中发现，α-苦瓜素虽能显著抑制人乳腺癌MCF-7移植瘤的增殖，但同时也能引起动物食欲减退、精神萎靡、肝功能异常等[3，14]；因此阐明α-苦瓜素肝细胞损伤机制可为其药物开发提供依据。 本研究发现，流式细胞术检测质量浓度为160 μg/mL的α-苦瓜素浓度作用于L02细胞8 h后可诱导L02细胞早期凋亡。α-苦瓜素作用L02细胞后，其促调蛋白p-JNK、p-Bad、Caspase-9蛋白水平显著升高，并在给药后0.25～2 h达到高峰，而抑调蛋白p-p53、p-Akt、p-Bcl- 2、Caspase-8蛋白处于静止或被抑制状态，由此证明了α-苦瓜素具有诱导L02细胞凋亡的作用。JNK信号转导过程即当外源性刺激物与细胞膜受体结合，激活细胞内蛋白激酶导致JNK和下游Bad蛋白的磷酸化，Bad一方面可抑制Caspase-8，另一方面可活化Caspase-9，从而导致了细胞凋亡[15]。这7种凋亡蛋白是JNK信号转导的重要通路蛋白，本试验结果也符合JNK信号途径传递的细胞凋亡信息，初步揭示了α-苦瓜素诱导肝细胞凋亡的发生机制。
进一步的试验发现，当α-苦瓜素的特异性细胞受体LRP1被siRNA基因沉默后，JNK的信号途径的相关蛋白被明显抑制。LRP1是一种多配体共用受体，其细胞质区域具有由天冬酰胺残基（N）、脯氨酸残基（P）及任何氨基酸残基（x）和酪氨酸残基（Y）组成的两个信号结构域（NPxY）[16-17]，这些信号结构域可以作为信号转导位点参与下游信号传导，能通过MAPK信号通路来调节细胞增殖和凋亡[8]，JNK途径是MAPK通路的一种，主要发挥细胞凋亡的转导。因此，本试验结果也说明，α-苦瓜素的信号转导作用是由LRP1受体的介导完成的。
本研究初步证明，通过JNK信号通路转导的细胞凋亡是α-苦瓜素引起肝细胞毒性的早期发生机制。α-苦瓜素与LRP1结合后，被介导内吞入细胞中，抑制相关蛋白的表达，从而激发肝细胞凋亡，可为后续研究揭示α-苦瓜素的肝脏毒性发生机制提供参考。
参考文献
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（收稿日期：2018-07-11 修回日期：2018-10-24）
（编辑：唐晓莲）
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.08
摘 要 目的：探讨α-苦瓜素诱导肝细胞L02（简称“L02细胞”）早期凋亡的信号通路。方法：制备并纯化α-苦瓜素。采用流式细胞术检测0（阴性对照）、160、80 μg/mL α-苦瓜素作用L02细胞2～8 h后的细胞凋亡率。小干扰RNA（siRNA）沉默低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）得到LRP1-siRNA细胞，然后采用液相芯片分析术检测α-苦瓜素（160 μg/mL）分别作用L02细胞（正常组）和LRP1-siRNA细胞（沉默组）0、0.25、0.5、1、2 h后c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路中促调蛋白磷酸化JNK（p-JNK）、磷酸化凋亡前体蛋白（p-Bad）、胱天蛋白酶9（Caspase-9）及抑调蛋白磷酸化蛋白53（p-p53）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、磷酸化B淋巴细胞瘤2（p-Bcl-2）、Caspase-8的表达情况，分析α-苦瓜素对L02细胞JNK信号通路的作用。结果：制备并纯化得到α-苦瓜素（纯度>97%）；与阴性对照组比较，160 μg/mL α-苦瓜素作用8 h时，可显著诱导细胞早期凋亡（P<0.05），80 μg/mL α-苦瓜素诱导的早期凋亡不明显（P>0.05）；与0 h比较，作用后0.25 h促调蛋白p-JNK、p-Bad和Caspase-9表达量显著增加（P<0.05），而抑调蛋白p-p53、p-Akt、p-Bcl-2和Caspase-8表達量无变化；与正常组相比，沉默组各时间点的p-JNK、p-Bad和Caspase-9的表达均显著减少（P<0.05）。结论：α-苦瓜素可能通过LRP1受体介导JNK信号通路诱导肝细胞凋亡，为揭示其肝毒性提供了参考。
关键词 α-苦瓜素；凋亡；肝细胞L02；c-Jun氨基末端激酶信号通路；低密度脂蛋白受体相关蛋白1
ABSTRACT OBJECTIVE： To explore the signaling pathway of α-momordicin inducing early apoptosis of hepatocyte L02 （called “the L02 cell” for short）. METHODS： α-momordicin was prepared and purified. Flow cytometry was used to detect the apoptotic rate of the L02 cell after treated with 0 （negative control）， 160 and 80 μg/mL of α-momordicin for 2-8 h. LRP1-siRNA cells were obtained by small interfering RNA （siRNA） silencing low density lipoprotein receptor-related protein 1 （LRP1）. The expression of proapoptotic protein p-JNK， p-Bad， Caspase-9， inhibitor of apoptosis protein p-p53， p-Akt，p-Bcl-2 and active Caspase-8 in the L02 cell （normal group） and LRP1-siRNA （silence group） after treated with α-momordicin for 0， 0.25， 0.5， 1， 2 h were determined by liquid biochip analysis in c-Jun N-terminal kinase （JNK） signaling pathway. Effects of α-momordicin on JNK signaling pathway were analyzed. RESULTS： α-momordicin could be prepared and purified （purity>97%）. Compared with negative control group， 160 μg/mL α-momordicin could significantly induced early apoptosis of the cell after treated for 8 h （P<0.05）； early apoptosis of the cell induced by 80 μg/mL α-momordicin was not obvious （P>0.05）. Compared with 0 h， the expression of p-JNK， p-Bad and Caspase-9 were increased significantly and even reached the peak value 0.25 h after medication （P<0.05）， while the expression of p-p53， p-Akt， p-Bcl-2 and Caspase-8 had no change. Compared with normal group， the expression of p-JNK， p-Bad and Caspase-9 of silence group were decreased significantly at different time points （P<0.05）. CONCLUSIONS： α-momordicin can induce the apoptosis of hepatocytes via LRP1 receptor mediated JNK signaling pathway， and will provide the reference for its hepatotoxicity. KEYWORDS α-momordicin； Apoptosis； Hepatocyte L02； c-Jun N-terminal kinase signaling pathway； Low density lipoprotein receptor-related protein 1
α-苦瓜素是从苦瓜种子中提取的Ⅰ型核糖体失活蛋白（Ribosome-inactivating proteins，RIPs），具有抗肿瘤、抗病毒等多种药理学作用[1-2]。据相关研究报道，α-苦瓜素通过激活凋亡信号通路胱天蛋白酶3（Caspase-3），诱导乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞凋亡[3]。本课题组在前期试验中发现，α-苦瓜素虽能显著抑制MCF-7细胞移植瘤的增殖，但也能引起动物肝功能的异常和肝细胞的坏死[4-5]，使得其临床应用受到阻碍。
目前有研究发现，同为Ⅰ型RIPs的天花粉蛋白（TCS）能通过低密度脂蛋白受体相关蛋白1 （LRP 1）受体介导进入肿瘤细胞[6-7]。LRP1既是一种内吞型受体，同时也具有信号转导的功能，能激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）/促丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号转导途径调节细胞增殖和凋亡[8]。由于LRP1在肝细胞上分布极为丰富[9]，故笔者推测，α-苦瓜素可能通过该信号转导通路诱导肝细胞凋亡。
本研究以正常人胚肝细胞L02（简称“L02细胞”）为试验对象，以流式细胞术分析α-苦瓜素诱导的肝细胞凋亡，以液相芯片分析技術检测α-苦瓜素作用后，JNK信号通路凋亡信号蛋白中促调蛋白JNK、凋亡前体蛋白（Bad）、Caspase-9和抑调蛋白蛋白53（p53）、蛋白激酶B（Akt）、B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）、Caspase-8的表达水平变化，并以LRP1基因敲降法[10]验证该信号通路的LRP1 受体介导作用，从而阐明α-苦瓜素诱导细胞凋亡的发生途径，为揭示α-苦瓜素诱导的肝脏毒性发生机制提供参考。
1 材料
1.1 仪器
BX51倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；Accuri 6流式细胞仪（美国BD公司）； 76S/02324凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；Luminex 200液相芯片检测分析系统（美国Millipore公司）；AKTA蛋白质纯化系统（美国GE公司）；UltrafleⅩⅢ飞行时间质谱仪、MaXis电喷雾四级杆飞行时间质谱仪（美国Bruker 公司）。
1.2 药品与试剂
苦瓜种子（四川省农科院种子公司，批号：20160912）；Annexin Ⅴ-FITC凋亡试剂盒（美国BioVision公司，批号：K201-100）；RPMI-1640培养基（美国Gibco公司，批号：C11875500BT）；胎牛血清（美国HyClone公司，批号：NUCO53）；兔抗人LRP1抗体（美国Abcam公司，批号：AB7975）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（美国R&D公司，批号：HY90077）；β-肌动蛋白（β-actin）抗体（美国Novus公司）；人早凋信号蛋白检测试剂盒（内含Akt、JNK、Bad、Bcl-2、p53磷酸化抗体和Caspase-8、Caspase-9抗体，美国Millipore公司，批号：48-669MAG）；LRP1小干扰RNA（siRNA）试剂盒[内含A、B、C 3种序列siRNA和非特异性siRNA，3种序列siRNA分别为LRP1-siRNA-A（5′ -ACACCAAUAAGAAG- CAGAUCAAUGT-3′ ）、LRP1-siRNA-B（5′ -AGAUUUGUCCACAGAGUAAGGCCCA-3′ ）、LRP1-siRNA-C（5′ - GGCUGUGACUGACGAGGAACCGUTT-3′ ）]、Trans1.0转染试剂均购自美国Origene公司；细胞裂解液RIPA、蛋白酶抑制剂均购自美国Millipore公司。
1.3 细胞
人胚肝细胞L02购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
2 方法
2.1 α-苦瓜素的制备及纯化鉴定
将苦瓜种子研磨成粉末并用50 mmol/L醋酸盐缓冲溶液（pH=6.3）萃取，得到α-苦瓜素粗提样品；在2 ℃条件下向粗提物中加入250 mmol/L HCl增溶，1 000 r/min离心后，取上清液用1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.0）中和，再用硫酸铵沉淀蛋白，得硫酸铵沉淀蛋白样品；再分别经SP-琼脂糖凝胶色谱、离子交换层析、凝胶过滤色谱纯化后，得到α-苦瓜素蛋白纯品。分别对上述纯化过程收获的中间样品（硫酸铵沉淀蛋白样品、SP-琼脂糖凝胶色谱洗脱样品、离子交换层析样品）以及纯化后α-苦瓜素蛋白纯品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并对纯化后α-苦瓜素蛋白纯品进行高效液相色谱（HPLC）纯度测定和飞行时间质谱分子量分析以及电喷雾四极杆质谱N-末端氨基酸序列分析。
2.2 细胞培养
肝细胞L02采用含有10%胎牛血清、100 u/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基，于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。
2.3 α-苦瓜素诱导的细胞凋亡检测
按1×105个/孔将L02细胞接种在6孔板中，待细胞贴壁达50%～60%融合度时，分别加入终质量浓度为0（阴性对照）、80、160 μg/mL的α-苦瓜素，并于给药2、4、8 h后消化并重悬各孔细胞，加入5 μL Annexin Ⅴ和10 μL碘化丙啶（PI），用流式细胞仪检测细胞凋亡率，以FlowJo 10软件分析凋亡细胞的分布情况。
2.4 LRP1-siRNA转染细胞 将L02细胞接种于6孔板中，设置LRP1-siRNA-A组、LRP1-siRNA-B组、LRP1-siRNA-C组、非特异性siRNA组和阴性对照组（PBS）。当细胞生长融合度达到30～40%时，分别向各组培养基中加入4 μL 5 mmol/L的LRP1-siRNA（A、B、C 3种）、非特异性siRNA和PBS，然后加入20 μL Trans1.0转染试剂。转染4 h后，将培养液更换为含有双抗体（青霉素-链霉素）的10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，继续培养72 h。
2.5 Western blot法检测LRP1-siRNA沉默作用
采用Western blot检测siRNA基因的沉默效果。裂解“2.4”项各组细胞，提取蛋白，经SDS-PAGE分离、转膜、封闭、分别加入一抗兔抗人LRP1抗体（1 ∶ 20 000），过夜冷藏，TBST缓冲液洗膜，分别加入二抗HRP-羊抗兔IgG（1 ∶ 1 000），37 ℃孵育1 h，TBST缓冲液洗膜，采用化学发光法检测成像结果，β-actin作为内参对照，筛选出使LRP1蛋白缺失85%以上的阳性LRP1-siRNA用于后续试验。
2.6 液相芯片法检测α-苦瓜素对凋亡信号蛋白的影响
2.6.1 分组及给药 （1）正常组。将对数生长期的L02细胞接种于6孔板中，融合度60%时加入终质量浓度为160 ?g/mL的α-苦瓜素，分别于作用0、0.25、0.5、1、2 h后以RIPA裂解细胞并收集细胞裂解液样品，4 ℃下10 000 r/min离心，收集各上清液。（2）LRP1-siRNA沉默组。以“2.5”项筛选的阳性LRP1-siRNA转染L02细胞，培养72 h后，同上述方法给药处理，并收集各上清液。经BCA法测定如上所有上清样品的蛋白含量，并调整蛋白质量浓度至0.4 mg/mL，-80 ℃保存。
2.6.2 凋亡信号蛋白的检测 采用液相芯片分析系统检测各组细胞在α-苦瓜素（160 ?g/mL）作用0～2 h后磷酸化JNK （p-JNK）、磷酸化Bad（p-Bad）、Caspase-9、磷酸化p53（p-p53）、磷酸化Akt（p-Akt）、磷酸化Bcl-2（p-Bcl- 2）、Caspase-8的表达水平，具体试验操作严格参考人早凋信号蛋白检测试剂盒说明书，以检测的各组细胞目标蛋白的荧光强度（MFI值）反映其表达水平。将检测到的各组细胞中p-JNK、p-Bad、Caspase-9、p-p53、p-Akt、p-Bcl-2、Caspase-8的MFI值作为纵坐标，α-苦瓜素作用时间为横坐标，绘制荧光强度-时间曲线图。
2.7 统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 α-苦瓜素蛋白的纯化鉴定结果
纯化得到α-苦瓜素蛋白纯品，经HPLC色谱分析纯度大于97%；飞行时间质谱分析得出α-苦瓜素蛋白样品分子量为28 551.6 Da，电喷雾四极杆质谱分析得出该蛋白样品N-末端5个氨基酸序列N-天冬氨酸-缬氨酸-丝氨酸-苯丙氨酸-精氨酸，经查询，与NCBI公布的α-苦瓜素序列一致（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），表明纯化得到的蛋白样品即为α-苦瓜素蛋白。α-苦瓜素纯化过程及最终蛋白纯品的SDS-PAGE电泳结果见图1。
3.2 α-苦瓜素诱导L02细胞早期凋亡结果
流式细胞仪检测结果显示，α-苦瓜素质量浓度为160 μg/mL时，诱导L02细胞的细胞凋亡率分别为2.8%（2 h）、3.8%（4 h）和6.2%（8 h），α-苦瓜素質量浓度为80 μg/mL时，诱导L02细胞的细胞凋亡率分别为2.6%（2 h）、3.4%（4 h）和3.8%（8 h）。与阴性对照组比较，160 μg/mL（8 h）的细胞凋亡率显著升高（P<0.05），80 μg/mL各时段的细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。α-苦瓜素诱导L02细胞凋亡的检测结果如图2。
3.3 Western blot检测LRP1-siRNA的基因沉默结果
检测结果显示，L02细胞的LRP1受体经siRNA法基因沉默72 h后，LRP1-siRNA-C组蛋白条带缺失在85%以上，表现出了良好的沉默效果。L02细胞LRP1- siRNA沉默效果的蛋白电泳图见图3。
3.4 α-苦瓜素对L02细胞凋亡信号蛋白表达的影响结果
各组细胞中p-JNK、p-Bad、Caspase-9、p-p53、p-Akt、p-Bcl-2、Caspase-8荧光强度-时间曲线图见图4。
由图4可知，正常组于给药0.25 h时各促调蛋白p-JNK，p-Bad和活化Caspase-9表达达到高峰，直至给药2 h时依然处于较高水平，且与0 h比较有显著差异（P<0.05）；各抑调蛋白p-p53、p-Akt、p-Bcl-2、活化Caspase-8各时段表达无显著变化。与正常组比较，LRP1-siRNA沉默组各时段促调蛋白表达明显抑制（P<0.05），而抑凋蛋白的表达无显著变化。表明LRP1受体的基因沉默可以显著阻止α-苦瓜素对L02细胞的凋亡信号转导作用。
4 讨论
苦瓜入药在《本草纲目》《滇南本草》中早有记载[11]，从苦瓜种子中提取的α-苦瓜素具有抗肿瘤、抗病毒等作用，是一种药用价值较高的天然药物[1-2]。研究发现，α-苦瓜素属于RIPS，同天花粉蛋白一样，被证实对乳腺癌、绒毛膜细胞癌、黑色素瘤等皆有较强的抗肿瘤活性，已成为肿瘤治疗的候选药物之一[12-13]。在本课题组前期抗肿瘤试验中发现，α-苦瓜素虽能显著抑制人乳腺癌MCF-7移植瘤的增殖，但同时也能引起动物食欲减退、精神萎靡、肝功能异常等[3，14]；因此阐明α-苦瓜素肝细胞损伤机制可为其药物开发提供依据。 本研究发现，流式细胞术检测质量浓度为160 μg/mL的α-苦瓜素浓度作用于L02细胞8 h后可诱导L02细胞早期凋亡。α-苦瓜素作用L02细胞后，其促调蛋白p-JNK、p-Bad、Caspase-9蛋白水平显著升高，并在给药后0.25～2 h达到高峰，而抑调蛋白p-p53、p-Akt、p-Bcl- 2、Caspase-8蛋白处于静止或被抑制状态，由此证明了α-苦瓜素具有诱导L02细胞凋亡的作用。JNK信号转导过程即当外源性刺激物与细胞膜受体结合，激活细胞内蛋白激酶导致JNK和下游Bad蛋白的磷酸化，Bad一方面可抑制Caspase-8，另一方面可活化Caspase-9，从而导致了细胞凋亡[15]。这7种凋亡蛋白是JNK信号转导的重要通路蛋白，本试验结果也符合JNK信号途径传递的细胞凋亡信息，初步揭示了α-苦瓜素诱导肝细胞凋亡的发生机制。
进一步的试验发现，当α-苦瓜素的特异性细胞受体LRP1被siRNA基因沉默后，JNK的信号途径的相关蛋白被明显抑制。LRP1是一种多配体共用受体，其细胞质区域具有由天冬酰胺残基（N）、脯氨酸残基（P）及任何氨基酸残基（x）和酪氨酸残基（Y）组成的两个信号结构域（NPxY）[16-17]，这些信号结构域可以作为信号转导位点参与下游信号传导，能通过MAPK信号通路来调节细胞增殖和凋亡[8]，JNK途径是MAPK通路的一种，主要发挥细胞凋亡的转导。因此，本试验结果也说明，α-苦瓜素的信号转导作用是由LRP1受体的介导完成的。
本研究初步证明，通过JNK信号通路转导的细胞凋亡是α-苦瓜素引起肝细胞毒性的早期发生机制。α-苦瓜素与LRP1结合后，被介导内吞入细胞中，抑制相关蛋白的表达，从而激发肝细胞凋亡，可为后续研究揭示α-苦瓜素的肝脏毒性发生机制提供参考。
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（收稿日期：2018-07-11 修回日期：2018-10-24）
（编辑：唐晓莲）