【摘 要】
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目的 探讨人端粒酶逆转录酶的核心启动序列(hTERT)启动子驱动的双自杀基因系统CDglyTK真核质粒对肝癌细胞的特异性杀伤作用.方法 利用PCR扩增hTERT启动子、SV40、yCD及TKgly
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目的 探讨人端粒酶逆转录酶的核心启动序列(hTERT)启动子驱动的双自杀基因系统CDglyTK真核质粒对肝癌细胞的特异性杀伤作用.方法 利用PCR扩增hTERT启动子、SV40、yCD及TKgly基因片段,单独或共同连至pEGFP-C1质粒载体,分别构建pEGFP-hTERT-CD、pEGFP-hTERT-TK及pEGFP-hTERT-CDglyTK质粒,并转染SMMC7721肝癌细胞和HL7702正常人肝细胞,观察其转染效率并以RT-PCR、QPCR、Western印迹方法检测目的基因的表达,给予不同浓度的5-FC及更昔洛韦(GCV)处理,在用MTT法评估杀伤效应和旁观者效应,TRAP-银染法检测杀伤前后细胞端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞凋亡率,比较和分析联合基因与单基因疗效的差异.结果 最终质粒的酶切产物所得片段与预期一致,RT-PCR、QPCR及Western印迹结果显示目的基因CD、TK及CDglyTK高表达;pEGFP-hTERT-CD、pEGFP- hTERT-TK及pEGFP- hTERT-CDglyTK转染效率分别为74.5％、76.3％、76.9％.转染pEGFP-hTERT-CDglyTK的细胞较单基因转染对前药具有更高的敏感性(P =0.020,P=0.015)、促细胞凋亡作用(P =0.023,P=0.017)及旁观者效应(P =0.012,P=0.001),可更大程度降低端粒酶活性(P =0.045,P=0.038).HL7702细胞的转染及生长未受自杀基因系统的影响.结论 本研究构建的hTERT启动子驱动的双自杀基因(CDglyTK)系统质粒,在体外实验中对人肝癌细胞具有特异性的高杀伤作用.
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