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摘要：选取18头患不同程度隐性乳房炎奶牛和6头健康奶牛为试验动物，采集乳汁，分离乳清，利用比色法检测乳清中LDH、NAG活性，研究奶牛隐性乳房炎发病与乳清中LDH、NAG活性的关系。结果表明，随着隐性乳房炎病情加重，乳清中LDH、NAG活性呈升高的趋势。乳清中LDH、NAG活性与奶牛隐性乳房炎发病严重程度呈正相关性，随着体细胞数增加和乳腺炎症的加剧，乳清中LDH、NAG活性随之升高。
关键词：奶牛；隐性乳房炎；乳清；乳酸脱氢酶
中图分类号： S858.23 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0276-02
奶牛乳房炎是危害奶牛养殖业最严重的疾病之一，其中隐性乳房炎发生率最高。隐性乳房炎可引起泌乳奶牛产奶量下降、牛奶品质降低、养殖成本增加、产后发情延长、妊娠时间推迟，给奶牛养殖业带来巨大经济损失[1]。乳酸脱氢酶（LDH）和N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）广泛存在于动物组织及体液中，白细胞和乳腺上皮细胞损伤会引起乳中LDH活性改变[2]，炎症时白细胞释放NAG，病原菌破坏乳腺组织也可使NAG释放[3]。研究表明，奶牛乳房炎发病时引起乳汁体细胞数（SCC）增加，SCC作为监测奶牛乳房炎发病情况的可靠指标[4]，奶牛隐性乳房炎发病与乳中LDH、NAG酶活性相关，乳中SCC变化与乳酶活性呈正相关[5-6]。本研究探讨不同发病阶段的奶牛隐性乳房炎与乳汁中LDH、NAG酶活性的关系，旨在为该病的临床诊断提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物
乳汁体细胞计数监测后选择年龄、胎次、产奶量、泌乳期等指标相近的6头健康奶牛和18头患不同程度奶牛隐性乳房炎奶牛，由吉林市某奶牛场提供。
1.2 主要试剂与仪器
LDH检测试剂盒、NAG检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Fossmatic 5000体细胞计数仪（丹麦FOSS 公司）；Varioskan 酶标仪（美国Thermo 公司）；离心机（美国Sigma公司）。
1.3 试验动物分组
乳汁体细胞计数监测后将试验奶牛分成健康对照组（6头，SCC≤10×104个/mL）、轻度隐性乳房炎组（6头，50×104个/mL500×104个/mL）。
1.4 乳样采集
采集试验奶牛的乳汁，采样前对乳区进行清洗，用75%乙醇消毒乳区，弃掉头3 把乳汁，分别采乳10 mL装入无菌试管中，将乳样放入冰盒中，带回实验室检测。
1.5 乳清制备
将采集的乳样3 000 r/min离心5 min，除去上层乳脂，于16 000 r/min高速离心机中离心10 min，去除沉淀，保留上清，4 ℃保存，待测。
1.6 检测方法
采用体细胞计数仪测定乳汁体细胞数，采用LDH试剂盒测定LDH活性，采用NAG试剂盒测定NAG活性，在酶标仪上440 nm处比色测定D值，根据试剂盒说明书计算酶活性。
1.7 数据处理
采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，结果以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 奶牛乳清中LDH活性變化
如表1所示，患轻度奶牛隐性乳房炎奶牛乳清中LDH活性为（184.15±13.27）U/L，与对照组差异极显著；患中度奶牛隐性乳房炎奶牛乳清中LDH活性为（359.79±19.49）U/L，与对照组差异极显著；患重度奶牛隐性乳房炎奶牛乳清中LDH活性为（829.63±21.48）U/L，与对照组差异极显著。随着奶牛隐性乳房炎病情加重，乳清中LDH活性呈升高的趋势。
2.2 奶牛乳清中NAG活性变化
如表2所示，患轻度奶牛隐性乳房炎奶牛乳清中NAG活性为（42.44±8.55）U/L，与对照组差异显著；患中度奶牛隐性乳房炎奶牛乳清中NAG活性为（62.93±13.45）U/L，与对照组差异极显著；患重度奶牛隐性乳房炎奶牛乳清中NAG活性为（91.61±15.96）U/L，与对照组差异极显著。随着奶牛隐性乳房炎病情加重，乳清中NAG活性呈升高的趋势。
3 结论与讨论
3.1 奶牛隐性乳房炎与乳清中LDH相关性
LDH是由H和M亚基聚合成5种不同形式的四聚体，广泛存在于动物组织和体液中。研究表明，LDH活性与奶牛隐性乳房炎发病存在一定的联系[7]。Babaei等报道，患隐性乳房炎奶牛乳区乳汁中LDH活性显著高于正常乳区[5]。Hortet等报道，疾病导致乳腺功能的改变引起乳汁中LDH活性发生相应变化[8]。牛乳中LDH活性可作为监测隐性乳房炎的指标之一[9]。在隐性乳房炎发病过程中，LDH起着非常重要作用，可作为诊断隐性乳房炎和乳腺损害的重要指标之一。研究表明，乳房炎发病引起乳汁中LDH变化的主要原因是由于乳腺上皮细胞的破坏、炎症过程引起白细胞大量聚集，使损害的上皮细胞和大量的乳汁细胞释放LDH增多[10]。乳汁中LDH活性的增加量可以反映乳腺组织的损害程度[11]。本研究结果表明，奶牛隐性乳房炎发病引起乳汁中LDH活性升高，随着乳房炎病情的加重，乳汁中LDH活性呈逐渐升高趋势，LDH活性与乳腺损伤程度呈正相关。
3.2 奶牛隐性乳房炎与乳清中NAG相关性
NAG是一种溶菌酶，可作为乳腺上皮细胞破坏的标志[12]。乳房炎发病与NAG关系密切，乳房炎发生时血清中NAG活性明显升高，该酶可用作奶牛隐性乳房炎的诊断指标之一，对于隐性乳房炎的早期诊断具有重要意义[6]。研究发现，NAG在隐性乳房炎奶牛乳中NAG活性会增加，且与白细胞的增加有关[13-14]。NAG活性变化不仅与体细胞数量相关，且与不同细菌感染也有相关性[15]。葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌感染时，NAG活性与体细胞数相关系数较高[16-17]。本研究结果表明，奶牛隐性乳房炎发病引起乳汁中NAG活性升高，随着乳房炎病情的加重，乳汁中NAG活性呈逐渐升高的趋势。患隐性乳房炎奶牛乳清中LDH、NAG活性与奶牛隐性乳房炎发病程度呈正相关性，随着体细胞数增加和乳腺炎症的加剧，乳清中LDH、NAG活性随之升高。 参考文献：
[1]吴美玲，付静涛，王江涛，等. 影响奶牛隐性乳房炎发病率的主要因素[J]. 黑龙江畜牧兽医：下半月，2014（2）：49-50.
[2]石 晶，吕 英，李庆章. 乳酶作为奶牛隐性乳房炎诊断指标的研究进展[J]. 中国乳品工业，2010，38（8）：28-31.
[3]王 斌，靳亚平，林炜明，等. 奶牛乳腺炎分离细菌裂解苗免疫试验[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2004，32（6）：32-34.
[4]Eyassu S，Dokin E F，Elna M，et al. Potential of lact operoxidase to diagnose subclinical mastitis in goats[J]. Small Ruminant Research，2007，69（1/2/3）：154-158.
[5]Babaei H，Mansouri-Najand L，Molaei M M，et al. Assessment of lactate dehydrogenase，alkaline phosphatase and aspartate aminotransferase activities in cows milk as an indicator of subclinical mastitis[J]. Veterinary Research Communications，2007，31（4）：419-425.
[6]Pyrl S. Indicators of inflammation in the diagnosis of mastitis[J]. Veterinary Research，2003，34（5）：565-578.
[7]万善霞，滑 静，张淑萍. 牛初乳中几种重要酶及其生物功能的研究进展[J]. 北京农学院学报，2006，21（3）：77-80.
[8]Hortet P，Seegers H. Loss in milk yield and related composition changes resulting from clinical mastitis in dairy cows[J]. Preventive Veterinary Medicine，1998，37（1/2/3/4）：1-20.
[9]Symons D B，Wright L J. Changes in bovine mammary gland permeability after intramammary exotoxin infusion[J]. Journal of Comparative Pathology，1974，84（1）：9-17.
[10]Kitchen B J，Middleton G，Durward I G，et al. Mastitis diagnostic tests to estimate mammary gland epithelial cell damage[J]. Journal of Dairy Science，1980，63（6）：978-983.
[11]易顺华，吴显实，黎 江，等. 牛乳中酶活性与体细胞数的相关性分析[J]. 畜牧与兽医，2009，41（8）：67-69.
[12]Kitchen B J，Middleton G，Salmon M. Bovine milk N-acetyl-β-D-glucosaminidase and its significance in the detection of abnormal udder secretions[J]. The Journal of Dairy Research，1978，45（1）：15-20.
[13]Wilson D J，Herer P S，Sears P M. N-acetyl-β-D-glucosaminidase，etiologic agent，and duration of clinical signs for sequential episodes of chronic clinical mastitis in dairy cows[J]. Journal of Dairy Science，1991，74（5）：1539-1543.
[14]Berning L M，Shook G E. Prediction of mastitis using milk somatic cell count，N-acetyl-β-D-glucosaminidase，and lactose[J]. Journal of Dairy Science，1992，75（7）：1840-1848.
[15]Pyrl S，Pyrl E. Accuracy of methods using somatic cell count and N-acetyl-β-D-glucosaminidase activity in milk to assess the bacteriological cure of bovine clinical mastitis[J]. Journal of Dairy Science，1997，80（11）：2820-2825.
[16]馬保臣，秦卓明，李建基，等. 奶牛隐性乳腺炎病原菌的分离鉴定和体细胞数及酶的相关性研究[J]. 家畜生态学报，2006，27（2）：63-67.
[17]郭奇慧，云振宇，李 妍，等. 牛乳体细胞数与内源酶的关系[J]. 食品与生物技术学报，2007，26（4）：37-41.
关键词：奶牛；隐性乳房炎；乳清；乳酸脱氢酶
中图分类号： S858.23 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0276-02
奶牛乳房炎是危害奶牛养殖业最严重的疾病之一，其中隐性乳房炎发生率最高。隐性乳房炎可引起泌乳奶牛产奶量下降、牛奶品质降低、养殖成本增加、产后发情延长、妊娠时间推迟，给奶牛养殖业带来巨大经济损失[1]。乳酸脱氢酶（LDH）和N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）广泛存在于动物组织及体液中，白细胞和乳腺上皮细胞损伤会引起乳中LDH活性改变[2]，炎症时白细胞释放NAG，病原菌破坏乳腺组织也可使NAG释放[3]。研究表明，奶牛乳房炎发病时引起乳汁体细胞数（SCC）增加，SCC作为监测奶牛乳房炎发病情况的可靠指标[4]，奶牛隐性乳房炎发病与乳中LDH、NAG酶活性相关，乳中SCC变化与乳酶活性呈正相关[5-6]。本研究探讨不同发病阶段的奶牛隐性乳房炎与乳汁中LDH、NAG酶活性的关系，旨在为该病的临床诊断提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物
乳汁体细胞计数监测后选择年龄、胎次、产奶量、泌乳期等指标相近的6头健康奶牛和18头患不同程度奶牛隐性乳房炎奶牛，由吉林市某奶牛场提供。
1.2 主要试剂与仪器
LDH检测试剂盒、NAG检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Fossmatic 5000体细胞计数仪（丹麦FOSS 公司）；Varioskan 酶标仪（美国Thermo 公司）；离心机（美国Sigma公司）。
1.3 试验动物分组
乳汁体细胞计数监测后将试验奶牛分成健康对照组（6头，SCC≤10×104个/mL）、轻度隐性乳房炎组（6头，50×104个/mL500×104个/mL）。
1.4 乳样采集
采集试验奶牛的乳汁，采样前对乳区进行清洗，用75%乙醇消毒乳区，弃掉头3 把乳汁，分别采乳10 mL装入无菌试管中，将乳样放入冰盒中，带回实验室检测。
1.5 乳清制备
将采集的乳样3 000 r/min离心5 min，除去上层乳脂，于16 000 r/min高速离心机中离心10 min，去除沉淀，保留上清，4 ℃保存，待测。
1.6 检测方法
采用体细胞计数仪测定乳汁体细胞数，采用LDH试剂盒测定LDH活性，采用NAG试剂盒测定NAG活性，在酶标仪上440 nm处比色测定D值，根据试剂盒说明书计算酶活性。
1.7 数据处理
采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，结果以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 奶牛乳清中LDH活性變化
如表1所示，患轻度奶牛隐性乳房炎奶牛乳清中LDH活性为（184.15±13.27）U/L，与对照组差异极显著；患中度奶牛隐性乳房炎奶牛乳清中LDH活性为（359.79±19.49）U/L，与对照组差异极显著；患重度奶牛隐性乳房炎奶牛乳清中LDH活性为（829.63±21.48）U/L，与对照组差异极显著。随着奶牛隐性乳房炎病情加重，乳清中LDH活性呈升高的趋势。
2.2 奶牛乳清中NAG活性变化
如表2所示，患轻度奶牛隐性乳房炎奶牛乳清中NAG活性为（42.44±8.55）U/L，与对照组差异显著；患中度奶牛隐性乳房炎奶牛乳清中NAG活性为（62.93±13.45）U/L，与对照组差异极显著；患重度奶牛隐性乳房炎奶牛乳清中NAG活性为（91.61±15.96）U/L，与对照组差异极显著。随着奶牛隐性乳房炎病情加重，乳清中NAG活性呈升高的趋势。
3 结论与讨论
3.1 奶牛隐性乳房炎与乳清中LDH相关性
LDH是由H和M亚基聚合成5种不同形式的四聚体，广泛存在于动物组织和体液中。研究表明，LDH活性与奶牛隐性乳房炎发病存在一定的联系[7]。Babaei等报道，患隐性乳房炎奶牛乳区乳汁中LDH活性显著高于正常乳区[5]。Hortet等报道，疾病导致乳腺功能的改变引起乳汁中LDH活性发生相应变化[8]。牛乳中LDH活性可作为监测隐性乳房炎的指标之一[9]。在隐性乳房炎发病过程中，LDH起着非常重要作用，可作为诊断隐性乳房炎和乳腺损害的重要指标之一。研究表明，乳房炎发病引起乳汁中LDH变化的主要原因是由于乳腺上皮细胞的破坏、炎症过程引起白细胞大量聚集，使损害的上皮细胞和大量的乳汁细胞释放LDH增多[10]。乳汁中LDH活性的增加量可以反映乳腺组织的损害程度[11]。本研究结果表明，奶牛隐性乳房炎发病引起乳汁中LDH活性升高，随着乳房炎病情的加重，乳汁中LDH活性呈逐渐升高趋势，LDH活性与乳腺损伤程度呈正相关。
3.2 奶牛隐性乳房炎与乳清中NAG相关性
NAG是一种溶菌酶，可作为乳腺上皮细胞破坏的标志[12]。乳房炎发病与NAG关系密切，乳房炎发生时血清中NAG活性明显升高，该酶可用作奶牛隐性乳房炎的诊断指标之一，对于隐性乳房炎的早期诊断具有重要意义[6]。研究发现，NAG在隐性乳房炎奶牛乳中NAG活性会增加，且与白细胞的增加有关[13-14]。NAG活性变化不仅与体细胞数量相关，且与不同细菌感染也有相关性[15]。葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌感染时，NAG活性与体细胞数相关系数较高[16-17]。本研究结果表明，奶牛隐性乳房炎发病引起乳汁中NAG活性升高，随着乳房炎病情的加重，乳汁中NAG活性呈逐渐升高的趋势。患隐性乳房炎奶牛乳清中LDH、NAG活性与奶牛隐性乳房炎发病程度呈正相关性，随着体细胞数增加和乳腺炎症的加剧，乳清中LDH、NAG活性随之升高。 参考文献：
[1]吴美玲，付静涛，王江涛，等. 影响奶牛隐性乳房炎发病率的主要因素[J]. 黑龙江畜牧兽医：下半月，2014（2）：49-50.
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[4]Eyassu S，Dokin E F，Elna M，et al. Potential of lact operoxidase to diagnose subclinical mastitis in goats[J]. Small Ruminant Research，2007，69（1/2/3）：154-158.
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[11]易顺华，吴显实，黎 江，等. 牛乳中酶活性与体细胞数的相关性分析[J]. 畜牧与兽医，2009，41（8）：67-69.
[12]Kitchen B J，Middleton G，Salmon M. Bovine milk N-acetyl-β-D-glucosaminidase and its significance in the detection of abnormal udder secretions[J]. The Journal of Dairy Research，1978，45（1）：15-20.
[13]Wilson D J，Herer P S，Sears P M. N-acetyl-β-D-glucosaminidase，etiologic agent，and duration of clinical signs for sequential episodes of chronic clinical mastitis in dairy cows[J]. Journal of Dairy Science，1991，74（5）：1539-1543.
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[15]Pyrl S，Pyrl E. Accuracy of methods using somatic cell count and N-acetyl-β-D-glucosaminidase activity in milk to assess the bacteriological cure of bovine clinical mastitis[J]. Journal of Dairy Science，1997，80（11）：2820-2825.
[16]馬保臣，秦卓明，李建基，等. 奶牛隐性乳腺炎病原菌的分离鉴定和体细胞数及酶的相关性研究[J]. 家畜生态学报，2006，27（2）：63-67.
[17]郭奇慧，云振宇，李 妍，等. 牛乳体细胞数与内源酶的关系[J]. 食品与生物技术学报，2007，26（4）：37-41.