论文部分内容阅读
摘 要：该文通过对酶联免疫吸附分析（ELISA）实验在食品分析教学中实施情况进行探讨。介绍了该实验的基本原理以及实施过程，并以在食品安全检测领域中较常用的竞争ELISA为例，论述了用ELISA检测食品中有害小分子化学物质的实验步骤。为有关院校开展ELISA实验提供指导和借鉴。
关键词：酶联免疫吸附分析 综合性实验 教学
中图分类号：G421 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2013）05（a）-0149-02
食品分析是食品科学与工程专业重要的专业基础课程之一。食品分析实验课是食品分析教学的重要组成，是锻炼学生实验操作能力，分析解决问题能力的重要教学途径之一。酶联免疫吸附分析（ELISA）技术涉及有机化学、食品化学、生物化学和免疫学等综合知识内容，在食品分析学中开展ELISA综合性实验，不仅利于提高教学质量，而且能锻炼学生综合技能运用能力。
1 ELISA综合实验在教学中开展的意义
酶联免疫吸附分析技术是一种固相免疫分析方法，因其具有灵敏、快速、特异性强等特点，迅速发展，在食品安全检测领域应用越来越广泛，成为食品中小分子有害因子主要的快速筛查技术手段[1]。目前，对于食品中的农药、兽药残留，生物毒素，致病微生物等有害物质的分析，市面上已有商品化的ELISA试剂盒[2]。但本科教学极少开展ELISA教学，学生对其原理和操作了解较少，缺乏实验机会，相关知识的理解主要停留在理论教学水平。在食品专业开设ELISA实验课程，已成为一项非常必要的实验教学内容。有助于帮助学生学习对相关知识点的学习及掌握，提高学生对生物分析技术的认识，了解免疫分析技术在食品安全领域应用的优势及重要性，并锻炼学生动手能力，培养学生的综合素质。
2 ELISA实验的原理
ELISA技术是用酶标记的抗原或酶标记的抗体为主要试剂，通过复合物中的酶催化底物呈色反应来对被测物进行定性或定量的一种免疫分析方法[3]。其原理是把抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性，在测定时，将受检样品（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，形成抗原抗体复合物，用洗涤的方法使固相载体上的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与样品中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，通过定性或定量分析有色产物即可确定样品中待测物质的含量[4-5]。目前ELISA 的分类方法众多，主要技术类型有双抗体夹心法、间接法、捕获法、竞争法。在食品安全检测领域，竞争法为主要类型[6]。检测原理示意图见图1。
3 实施过程及具体实验步骤
根据笔者的教学经验，该综合性实验约需教学时数，10～12学时，具体操作过程如下。
（1）带教老师讲述ELISA的原理，应用及注意事项。
（2）通过观看酶联免疫吸附实验操作视频，了解整个实验流程及操作要点。
（3）将学生分组，每组3人，开展ELISA综合实验。
（4）实验操作结束，带教老师与学生共同讨论分析实验结果。
具体的实验操作步骤如下：
以测定牛奶和鱼肉中的氯霉素为例，采用酶标抗原的直接竞争法，介绍本实验具体实验步骤。
（1）包板：将抗体用包被液稀释一定的倍数，加入96孔酶标板中，100 μL/孔。37 ℃孵育，过夜。
（2）封板：洗板两次，加入封闭液120 μL/孔，37 ℃孵育，3小时。
（3）样品前处理：封板时，分别对样品牛奶和鸡肉进行前处理。
（4）烘干：将封闭好的板倒掉封闭液，37℃烘干。
（5）加样：加标准品/样本50 ?L/孔，然后加入酶标记物50 ?L/孔，再振荡混匀，用封板膜盖板，37 ℃条件下反应30 min。
（6）显色：洗板4～5次，每次浸泡30s，拍干。每孔加入底物缓冲液50 ?L，再加底物液50 ?L，轻轻振荡混匀，37 ℃或室温环境避光显色10 min。
（7）测定：每孔加入终止液50 ?L，轻轻振荡匀，设定酶标仪于450 nm处测定吸光度值。
（8）结果判定：以标准品百分吸光率为纵坐标，以氯霉素标准品浓度（ng/mL）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氯霉素实际浓度。
4 结语
ELISA实验是一个综合性实验，涉及到有机化学，食品化学，生物化学以及免疫学等方面的相关知识。因此，学生通过本实验，可以取得以下效果：（1）巩固理论知识，加强对相关知识的理解，并对该技术在食品安全检测领域的重要性有一定的认识。（2）结合视频及具体实验操作，了解整个实验的操作流程。（3）学生之间分组进行实验，加强相互协作及团队意识。
在食品科学与工程、食品营养、食品质量与安全、生物工程等专业的食品分析实验课中，我们为部分同学开设了ELISA综合实验，检测过的对象包括氯霉素、盐酸克伦特罗、三聚氰胺、和孔雀石绿等。本实验内容丰富充实，实验现象生动有趣，深受学生的欢迎。
参考文献
[1] 何紫薇，郭琦.酶联免疫吸附（ELISA）技术在食品检验的发展应用[J].生物科技与医药卫生，2011（11）：71-72.
[2] 李明尧.酶联免疫吸附（ELISA）技术在食品检验的发展应用[J].中国医药指南，2012，10（35）：380-381.
[3] 王守法，阚春月，许学书.酶联免疫吸附试验在食品检测中的应用[J].食品科学，2009，30（23）：489-492.
[4] 孙太凡.酶联免疫吸附分析技术在农药残留分析中的应用[J].安徽农业科学，2010，38（22）：11981-11983.
[5] Yu-Dong Shen， Xing-Fei Deng， Zhen-Lin Xu，et al. Simultaneous determination of malachite green，brilliant green and crystal violet in grass carp tissues by a broad-specificity indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay[J].Analytica Chimica Acta， 2011，707（1/2）：148-154.
[6] 张占军，王富花.酶联免疫吸附技术及其在食品安全检测中的应用[J].食品研究与开发，2011，32（1）：157-159.
关键词：酶联免疫吸附分析 综合性实验 教学
中图分类号：G421 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2013）05（a）-0149-02
食品分析是食品科学与工程专业重要的专业基础课程之一。食品分析实验课是食品分析教学的重要组成，是锻炼学生实验操作能力，分析解决问题能力的重要教学途径之一。酶联免疫吸附分析（ELISA）技术涉及有机化学、食品化学、生物化学和免疫学等综合知识内容，在食品分析学中开展ELISA综合性实验，不仅利于提高教学质量，而且能锻炼学生综合技能运用能力。
1 ELISA综合实验在教学中开展的意义
酶联免疫吸附分析技术是一种固相免疫分析方法，因其具有灵敏、快速、特异性强等特点，迅速发展，在食品安全检测领域应用越来越广泛，成为食品中小分子有害因子主要的快速筛查技术手段[1]。目前，对于食品中的农药、兽药残留，生物毒素，致病微生物等有害物质的分析，市面上已有商品化的ELISA试剂盒[2]。但本科教学极少开展ELISA教学，学生对其原理和操作了解较少，缺乏实验机会，相关知识的理解主要停留在理论教学水平。在食品专业开设ELISA实验课程，已成为一项非常必要的实验教学内容。有助于帮助学生学习对相关知识点的学习及掌握，提高学生对生物分析技术的认识，了解免疫分析技术在食品安全领域应用的优势及重要性，并锻炼学生动手能力，培养学生的综合素质。
2 ELISA实验的原理
ELISA技术是用酶标记的抗原或酶标记的抗体为主要试剂，通过复合物中的酶催化底物呈色反应来对被测物进行定性或定量的一种免疫分析方法[3]。其原理是把抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性，在测定时，将受检样品（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，形成抗原抗体复合物，用洗涤的方法使固相载体上的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与样品中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，通过定性或定量分析有色产物即可确定样品中待测物质的含量[4-5]。目前ELISA 的分类方法众多，主要技术类型有双抗体夹心法、间接法、捕获法、竞争法。在食品安全检测领域，竞争法为主要类型[6]。检测原理示意图见图1。
3 实施过程及具体实验步骤
根据笔者的教学经验，该综合性实验约需教学时数，10～12学时，具体操作过程如下。
（1）带教老师讲述ELISA的原理，应用及注意事项。
（2）通过观看酶联免疫吸附实验操作视频，了解整个实验流程及操作要点。
（3）将学生分组，每组3人，开展ELISA综合实验。
（4）实验操作结束，带教老师与学生共同讨论分析实验结果。
具体的实验操作步骤如下：
以测定牛奶和鱼肉中的氯霉素为例，采用酶标抗原的直接竞争法，介绍本实验具体实验步骤。
（1）包板：将抗体用包被液稀释一定的倍数，加入96孔酶标板中，100 μL/孔。37 ℃孵育，过夜。
（2）封板：洗板两次，加入封闭液120 μL/孔，37 ℃孵育，3小时。
（3）样品前处理：封板时，分别对样品牛奶和鸡肉进行前处理。
（4）烘干：将封闭好的板倒掉封闭液，37℃烘干。
（5）加样：加标准品/样本50 ?L/孔，然后加入酶标记物50 ?L/孔，再振荡混匀，用封板膜盖板，37 ℃条件下反应30 min。
（6）显色：洗板4～5次，每次浸泡30s，拍干。每孔加入底物缓冲液50 ?L，再加底物液50 ?L，轻轻振荡混匀，37 ℃或室温环境避光显色10 min。
（7）测定：每孔加入终止液50 ?L，轻轻振荡匀，设定酶标仪于450 nm处测定吸光度值。
（8）结果判定：以标准品百分吸光率为纵坐标，以氯霉素标准品浓度（ng/mL）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氯霉素实际浓度。
4 结语
ELISA实验是一个综合性实验，涉及到有机化学，食品化学，生物化学以及免疫学等方面的相关知识。因此，学生通过本实验，可以取得以下效果：（1）巩固理论知识，加强对相关知识的理解，并对该技术在食品安全检测领域的重要性有一定的认识。（2）结合视频及具体实验操作，了解整个实验的操作流程。（3）学生之间分组进行实验，加强相互协作及团队意识。
在食品科学与工程、食品营养、食品质量与安全、生物工程等专业的食品分析实验课中，我们为部分同学开设了ELISA综合实验，检测过的对象包括氯霉素、盐酸克伦特罗、三聚氰胺、和孔雀石绿等。本实验内容丰富充实，实验现象生动有趣，深受学生的欢迎。
参考文献
[1] 何紫薇，郭琦.酶联免疫吸附（ELISA）技术在食品检验的发展应用[J].生物科技与医药卫生，2011（11）：71-72.
[2] 李明尧.酶联免疫吸附（ELISA）技术在食品检验的发展应用[J].中国医药指南，2012，10（35）：380-381.
[3] 王守法，阚春月，许学书.酶联免疫吸附试验在食品检测中的应用[J].食品科学，2009，30（23）：489-492.
[4] 孙太凡.酶联免疫吸附分析技术在农药残留分析中的应用[J].安徽农业科学，2010，38（22）：11981-11983.
[5] Yu-Dong Shen， Xing-Fei Deng， Zhen-Lin Xu，et al. Simultaneous determination of malachite green，brilliant green and crystal violet in grass carp tissues by a broad-specificity indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay[J].Analytica Chimica Acta， 2011，707（1/2）：148-154.
[6] 张占军，王富花.酶联免疫吸附技术及其在食品安全检测中的应用[J].食品研究与开发，2011，32（1）：157-159.