【摘 要】
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目的 探讨Tau蛋白酪氨酸磷酸化对其表达的影响及Src家族在其酪氨酸磷酸化中作用及分子机制.?方法 采用无缝克隆方法构建Src家族(Src、Fyn、Yes、Lck、Blk、Fgr、Lyn和Hck)质
【机 构】
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中国人民解放军东部战区空军医院神经内科
【基金项目】
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南京军区医学科技创新课题(15MS073)。
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目的 探讨Tau蛋白酪氨酸磷酸化对其表达的影响及Src家族在其酪氨酸磷酸化中作用及分子机制.?方法 采用无缝克隆方法构建Src家族(Src、Fyn、Yes、Lck、Blk、Fgr、Lyn和Hck)质粒;Western blot检测HEK-293T和SHSY-5Y细胞共转染hTau(2N4R)-V5和Src家族24h后磷酸化和总Tau蛋白表达;免疫荧光和Western blot检测HEK-293T中hTau(2N4R)酪氨酸磷酸化(Tyrosine,Y)突变质粒hTau蛋白表达;Western blot检测转染hTau的HEK-293T细胞在共转染Fyn或Src质粒后Tau、Fyn和p-Tyr蛋白表达;Western blot检测转染hTau的Fyn KO的SHSY-5Y细胞中Fyn、Tau、Y394、P62和LC3II/I表达;免疫荧光检测PS19和WT小鼠神经元Y383表达;Western blot检测PS19和WT小鼠海马神经元原代细胞中Fyn、Y383、P62和LC3II/I表达. 结果Src和Fyn组HEK293T细胞的hTau-V5、Tau5、Tau5A6、Tau46和DakoTau蛋白表达显著高于Con组,差异有统计学意义(t=14.625、15.550、32.269、28.172、38.516,P0.05);与Con组相比,Src家族HEK293T和SHSY-5Y细胞的pT231、pS202、pS396/404、p-S262/356和pT181蛋白表达无统计学意义(P>0.05);与WT、Y18F、Y29F、Y197F和Y310F组相比,Y394F组V5和DakoTau蛋白显著降低(t=12.762、18.964,P0.05),p-Tyr蛋白表达明显降低(t=36.261、15.514,P<0.05);转染Fyn-KO的SHSY-5Y细胞中Y394、P62和hTau蛋白表达明显低于Fyn-WT组(t=15.562、39.298、22.374,P<0.05),LC3II/LC3I蛋白表达比例明显高于Fyn-WT组(t=56.261,P<0.05);PS19小鼠海马Y383(人Y394)、Fyn、P62蛋白表达明显升高(t=9.120、18.626、22.194,P<0.05),LC3II/LC3I蛋白表达显著降低(t=45.689,P<0.05).?结论 Fyn蛋白调控Tau蛋白Y394位点酪氨酸磷酸化影响Tau蛋白表达,通过下调Fyn可激活自噬抑制Tau蛋白的表达.
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