【摘 要】
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单链阻遏蛋白RRTRES是噬菌体434阻遏蛋白的衍生物, 含有两个DBD(DNA结合结构域), 一个是野生型噬菌体434的 DBD-R, 另一个是突变型DBD-RTRES, 二者用重组接头以头接尾的方式
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单链阻遏蛋白RRTRES是噬菌体434阻遏蛋白的衍生物, 含有两个DBD(DNA结合结构域), 一个是野生型噬菌体434的 DBD-R, 另一个是突变型DBD-RTRES, 二者用重组接头以头接尾的方式连接起来. RTRES的a-3-螺旋中-1, 1, 2, 5 位DNA结合氨基酸分别为T, R, E, S. 利用核心序列是CATACAAGAAAGNNNNNNTTTATG的随机DNA库, 体外循环筛选RTRES的DNA结合位点, 将筛选到的群体克隆、测序. 单链阻遏蛋白 RRTRES的亲和力测定表明, 最适操纵区序列含有TTAC或 TTCC(上述画线部分)时, Kd值在10-12~10-11 mol/L的范围. 天然噬菌体434阻遏蛋白与其操纵区的亲和力的Kd值在10-9 mol/L数量级, 与之相比, 所筛选操纵区的亲和力明显提高. 同时发现, 亲和力大小还受到最适结合位点两侧碱基的影响, 特别是5′位碱基的影响. 根据RTRES的识别特性, 设计了共有序列为 GTAAGAAARNTTACN或GGAAGAAARNTTCCN (R为A或G)的单链阻遏蛋白RTRES RTRE的操纵区序列. 结果表明, 它们之间有特异性结合, 且亲和力也很高. 此方法可望用于其他DNA结合蛋白新的结合特异性的筛选.
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