论文部分内容阅读
摘要：2006年从辽宁省不同地区采集蔬菜灰霉病果或病叶，经分离共获得灰霉病菌株86株。采用菌丝生长速率法测定了其对嘧霉胺的敏感性。试验结果表明，灰霉病菌对嘧霉胺产生中等水平抗药性，抗性频率为17.41％。经紫外、药剂联合诱导获得了高抗菌株，抗性倍数最高达62.78倍。嘧霉胺与多菌灵和腐霉利间不存在交互抗药性，苯胺基嘧啶类杀菌剂之间存在交互抗性。野生抗性菌株具有较好的遗传稳定性，连续转接9次后抗药性无明显下降。不同菌株的菌丝生长速度、鲜重和产孢量存在明显差异，但该差异与灰霉病菌对嘧霉胺的敏感性无相关性。
关键词：灰葡萄孢菌；嘧霉胺；抗药性
中图分类号
由灰葡萄孢菌引起的番茄灰霉病是保护地蔬菜生产上危害最严重的病害之一。自20世纪70年代以来，生产上相继用多菌灵、腐霉利、乙烯菌核利等杀菌剂防治该病害，但病原菌在短时间内陆续对这些杀菌剂产生了抗药性，甚至出现了多重抗药性菌株，田间防效明显下降。嘧霉胺(pyrimethanil)是嘧啶胺类杀菌剂，对灰霉病特效，兼有保护和治疗作用。20世纪90年代初，嘧霉胺率先在欧洲大面积推广，用以防治葡萄、草莓等作物的灰霉病。1998年嘧霉胺在我国首次获得农药登记，同年开始在辽宁省保护地番茄推广使用。本试验旨在测定辽宁省蔬菜灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性水平，并研究抗药性菌株的生物学特性。
1、材料与方法
1.1供试材料
供试菌株：2006年3～5月，自辽宁省沈阳、鞍山、大连、辽阳、朝阳、抚顺、本溪、铁岭8个城市的温室中，采集已经使用过嘧霉胺却发生灰霉病的病果或病叶。在PDA培养基上分离灰葡萄孢菌，共获得代表性菌株86株。杀菌剂：95.5％嘧霉胺原药(昆山瑞泽农药股份有限公司)；90.5％多菌灵原药(沈阳农药厂生产)；50％腐霉利可湿性粉剂(速克灵，日本住友化学工业株式会社生产)；50％嘧菌环胺水分散剂(先正达公司生产)。
1.2灰霉病菌对嘧霉胺敏感性的测定
采用菌丝生长速率法测定各菌株的EG。值。培养基采用L-asp：K2HPO4、MgSO4·7H2O各1 g，KCl0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，L-天冬酰胺2 g，葡萄糖22 g，琼脂20 g，加蒸馏水至1 L。灰葡萄孢对嘧霉胺的敏感性划分标准：当某菌株的EG。<0.4μg／mL时，为敏感菌株(S)；当0.45≤EC50<0.90μg／mL时，为中抗菌株(MR)；当EC50≥0.90μg／mL时，为高抗菌株(HR)。
1.3紫外、药剂联合诱导抗药性
在含有嘧霉胺不同浓度及对照的L-asp培养基平板上，涂抹0.1 mL供试菌株C2、H9、F35的分生孢子悬浮液，涂匀后25℃培养2 h。然后置于稳定紫外灯(25 W)400 mm下照射，照射时间分别为30、60、90、120 s。然后放入恒温培养箱25℃培养3 d，数每个平板长出的菌落数，挑取长出的菌落边缘置于含1 μg／mL嘧霉胺L-asp平板上，能够生长的菌落即为抗药性突变体。
1.4嘧霉胺与嘧菌环胺、多菌灵和腐霉利的交互抗药性测定
采用菌丝生长速率法，测定多菌灵和腐霉利对HH9、H5、F22、F79、C11、H11共6株灰霉病菌分别将嘧霉胺与嘧菌环胺、多菌灵及腐霉利的EC50作直线相关分析。
1.5抗性菌株遗传稳定性测定
将野生中抗菌株H4和室内诱导获得的高抗菌株HH9接种到无药平板上，连续转接9次，分别测定第3、6、9次转接菌对嘧霉胺的敏感性。
1.6不同敏感性菌株生物学特性测定
菌丝生长速度：将HH9、H4、H9、H2、F22、C106株灰霉病菌的菌碟分别置于无药平板上，25℃培养3 d后，测量菌落直径。菌丝鲜重：将6株灰霉病菌菌碟放入装有50 mL液体培养基的三角瓶中，22℃、130 r／min振荡培养5 d，菌丝过滤清洗后，测量鲜重。产孢量：将6株灰霉病菌菌碟移入PSA平板上，22℃培养15 d，每皿中加入10 mL无菌水，冲洗孢子，过滤，得孢子悬浮液，用血球计数板记录孢子数。
2、结果与分析
2.1灰霉病菌对嘧霉胺的敏感性
经分离共获得代表嘧霉胺不同使用历史的灰霉病菌86株，采用菌丝生长速率法测定嘧霉胺对各菌株的EC50。结果表明，其中9株属中抗菌株，占测定菌株的10.47％，6株属高抗菌株，占测定的6.98％。以F66最敏感，EC50为0.037 2μg／mL，C13抗性最大，EC50达到3.161μg／mL。
2.2灰霉病菌对嘧霉胺诱导抗药性
采用紫外、药剂联合诱导，供试菌株全部被诱导为高抗菌株(表1)，EC50最高达5.719 5μg／mL，是敏感基线0.091 1的62.78倍。
2.4抗性菌株遗传稳定性
室内诱导高抗菌株HH。及野生中抗菌株H4在无药平板上连续转接，其EC50值逐渐下降(见表2)。转接9次后，HH9的EC50值降低了67.9倍。而H4的EC50值下降缓慢，始终保持着对嘧霉胺的中等抗药性，表明野生抗性菌株有较好的遗传稳定性。
3、结论与讨论
试验结果表明，辽宁省灰霉病菌已对嘧啶胺类杀菌剂嘧霉胺产生抗药性，但仍处于中等抗性水平，平均抗药性频率达17.41％；不同地区抗药性频率存在差异，嘧霉胺使用较多的沈阳市、辽阳市、大连市和鞍山市抗药性频率较高。在离体条件下，抗药性菌株具有良好的遗传稳定性及与敏感菌株相似的适应性，这意味着抗药性菌株在田间具有较高的适合度，如果嘧霉胺长期、连续使用将导致抗药性菌株比例上升，防治失败。
苯并咪唑类杀菌剂多菌灵与二甲酰亚胺类杀菌剂腐霉利作为防治灰霉病的主要药剂在许多蔬菜产地已产生抗药性。交互抗性测定结果表明，此二类杀菌剂与嘧霉胺不存在交互抗性，可以用来治理对多菌灵和腐霉利产生抗性的灰霉病菌。嘧啶胺类杀菌剂嘧菌环胺目前尚未在辽宁省大面积推广使用，从其与同类杀菌剂嘧霉胺之间存在正交互抗性结果看出，灰霉病菌也可能对嘧菌环胺产生抗药性。因此，为延缓其抗性产生，建议与不同作用机制的杀菌剂轮换使用，制定合理的用药次数与频率。
嘧霉胺作用位点单一，属高抗药性风险杀菌剂。近年已有多篇关于灰葡萄孢菌对嘧霉胺产生抗药性的报道，甚至出现了高抗药性菌株。嘧霉胺在辽宁省目前仍是防治灰霉病的有效药剂。但许多农民习惯于连年使用同种杀菌剂，且一季喷洒多次，这给病原菌产生抗药性创造了极为有利的条件，为延长嘧霉胺的使用寿命，避免因产生严重抗性给生产造成重大损失，建议根据不同地区的抗药性水平积极采取相应措施，如推广综合防治技术、减少每季用药次数、与不同作用机制的杀菌剂复配或交替使用等。
关键词：灰葡萄孢菌；嘧霉胺；抗药性
中图分类号
由灰葡萄孢菌引起的番茄灰霉病是保护地蔬菜生产上危害最严重的病害之一。自20世纪70年代以来，生产上相继用多菌灵、腐霉利、乙烯菌核利等杀菌剂防治该病害，但病原菌在短时间内陆续对这些杀菌剂产生了抗药性，甚至出现了多重抗药性菌株，田间防效明显下降。嘧霉胺(pyrimethanil)是嘧啶胺类杀菌剂，对灰霉病特效，兼有保护和治疗作用。20世纪90年代初，嘧霉胺率先在欧洲大面积推广，用以防治葡萄、草莓等作物的灰霉病。1998年嘧霉胺在我国首次获得农药登记，同年开始在辽宁省保护地番茄推广使用。本试验旨在测定辽宁省蔬菜灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性水平，并研究抗药性菌株的生物学特性。
1、材料与方法
1.1供试材料
供试菌株：2006年3～5月，自辽宁省沈阳、鞍山、大连、辽阳、朝阳、抚顺、本溪、铁岭8个城市的温室中，采集已经使用过嘧霉胺却发生灰霉病的病果或病叶。在PDA培养基上分离灰葡萄孢菌，共获得代表性菌株86株。杀菌剂：95.5％嘧霉胺原药(昆山瑞泽农药股份有限公司)；90.5％多菌灵原药(沈阳农药厂生产)；50％腐霉利可湿性粉剂(速克灵，日本住友化学工业株式会社生产)；50％嘧菌环胺水分散剂(先正达公司生产)。
1.2灰霉病菌对嘧霉胺敏感性的测定
采用菌丝生长速率法测定各菌株的EG。值。培养基采用L-asp：K2HPO4、MgSO4·7H2O各1 g，KCl0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，L-天冬酰胺2 g，葡萄糖22 g，琼脂20 g，加蒸馏水至1 L。灰葡萄孢对嘧霉胺的敏感性划分标准：当某菌株的EG。<0.4μg／mL时，为敏感菌株(S)；当0.45≤EC50<0.90μg／mL时，为中抗菌株(MR)；当EC50≥0.90μg／mL时，为高抗菌株(HR)。
1.3紫外、药剂联合诱导抗药性
在含有嘧霉胺不同浓度及对照的L-asp培养基平板上，涂抹0.1 mL供试菌株C2、H9、F35的分生孢子悬浮液，涂匀后25℃培养2 h。然后置于稳定紫外灯(25 W)400 mm下照射，照射时间分别为30、60、90、120 s。然后放入恒温培养箱25℃培养3 d，数每个平板长出的菌落数，挑取长出的菌落边缘置于含1 μg／mL嘧霉胺L-asp平板上，能够生长的菌落即为抗药性突变体。
1.4嘧霉胺与嘧菌环胺、多菌灵和腐霉利的交互抗药性测定
采用菌丝生长速率法，测定多菌灵和腐霉利对HH9、H5、F22、F79、C11、H11共6株灰霉病菌分别将嘧霉胺与嘧菌环胺、多菌灵及腐霉利的EC50作直线相关分析。
1.5抗性菌株遗传稳定性测定
将野生中抗菌株H4和室内诱导获得的高抗菌株HH9接种到无药平板上，连续转接9次，分别测定第3、6、9次转接菌对嘧霉胺的敏感性。
1.6不同敏感性菌株生物学特性测定
菌丝生长速度：将HH9、H4、H9、H2、F22、C106株灰霉病菌的菌碟分别置于无药平板上，25℃培养3 d后，测量菌落直径。菌丝鲜重：将6株灰霉病菌菌碟放入装有50 mL液体培养基的三角瓶中，22℃、130 r／min振荡培养5 d，菌丝过滤清洗后，测量鲜重。产孢量：将6株灰霉病菌菌碟移入PSA平板上，22℃培养15 d，每皿中加入10 mL无菌水，冲洗孢子，过滤，得孢子悬浮液，用血球计数板记录孢子数。
2、结果与分析
2.1灰霉病菌对嘧霉胺的敏感性
经分离共获得代表嘧霉胺不同使用历史的灰霉病菌86株，采用菌丝生长速率法测定嘧霉胺对各菌株的EC50。结果表明，其中9株属中抗菌株，占测定菌株的10.47％，6株属高抗菌株，占测定的6.98％。以F66最敏感，EC50为0.037 2μg／mL，C13抗性最大，EC50达到3.161μg／mL。
2.2灰霉病菌对嘧霉胺诱导抗药性
采用紫外、药剂联合诱导，供试菌株全部被诱导为高抗菌株(表1)，EC50最高达5.719 5μg／mL，是敏感基线0.091 1的62.78倍。
2.4抗性菌株遗传稳定性
室内诱导高抗菌株HH。及野生中抗菌株H4在无药平板上连续转接，其EC50值逐渐下降(见表2)。转接9次后，HH9的EC50值降低了67.9倍。而H4的EC50值下降缓慢，始终保持着对嘧霉胺的中等抗药性，表明野生抗性菌株有较好的遗传稳定性。
3、结论与讨论
试验结果表明，辽宁省灰霉病菌已对嘧啶胺类杀菌剂嘧霉胺产生抗药性，但仍处于中等抗性水平，平均抗药性频率达17.41％；不同地区抗药性频率存在差异，嘧霉胺使用较多的沈阳市、辽阳市、大连市和鞍山市抗药性频率较高。在离体条件下，抗药性菌株具有良好的遗传稳定性及与敏感菌株相似的适应性，这意味着抗药性菌株在田间具有较高的适合度，如果嘧霉胺长期、连续使用将导致抗药性菌株比例上升，防治失败。
苯并咪唑类杀菌剂多菌灵与二甲酰亚胺类杀菌剂腐霉利作为防治灰霉病的主要药剂在许多蔬菜产地已产生抗药性。交互抗性测定结果表明，此二类杀菌剂与嘧霉胺不存在交互抗性，可以用来治理对多菌灵和腐霉利产生抗性的灰霉病菌。嘧啶胺类杀菌剂嘧菌环胺目前尚未在辽宁省大面积推广使用，从其与同类杀菌剂嘧霉胺之间存在正交互抗性结果看出，灰霉病菌也可能对嘧菌环胺产生抗药性。因此，为延缓其抗性产生，建议与不同作用机制的杀菌剂轮换使用，制定合理的用药次数与频率。
嘧霉胺作用位点单一，属高抗药性风险杀菌剂。近年已有多篇关于灰葡萄孢菌对嘧霉胺产生抗药性的报道，甚至出现了高抗药性菌株。嘧霉胺在辽宁省目前仍是防治灰霉病的有效药剂。但许多农民习惯于连年使用同种杀菌剂，且一季喷洒多次，这给病原菌产生抗药性创造了极为有利的条件，为延长嘧霉胺的使用寿命，避免因产生严重抗性给生产造成重大损失，建议根据不同地区的抗药性水平积极采取相应措施，如推广综合防治技术、减少每季用药次数、与不同作用机制的杀菌剂复配或交替使用等。