【摘 要】
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目的:构建携带前列腺凋亡反应因子-4(prostate apoptosis response-4,PAR-4)基因PRKC apoptosis WT1 regulator(pawr)表达的重组腺病毒载体,研究PAR-4对胰岛β细胞株NIT-1的
【机 构】
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第三军医大学第一附属医院内分泌科,第三军医大学第一附属医院门诊部
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目的:构建携带前列腺凋亡反应因子-4(prostate apoptosis response-4,PAR-4)基因PRKC apoptosis WT1 regulator(pawr)表达的重组腺病毒载体,研究PAR-4对胰岛β细胞株NIT-1的影响。方法:利用Oligo Designer3.0设计Pawr模版引物,通过RT-PCR扩增出pawr基因片段,使用双酶切克隆至腺病毒载体ADV1,构建重组载体质粒p Ad Track-pawr-CMV。线性化p Ad Track-pawr-CMV和p Ad-Easy-1共同转化到感受态大肠杆菌构建重组腺病毒载体质粒p Ad Track-pawr。将NIT-1细胞分为4组:低糖组、高糖对照组、低糖+PAR-4过表达组以及高糖+PAR-4过表达组,Western blot检测各组PAR-4蛋白表达,MTT法检测各组细胞增殖能力,ELISA检测经葡萄糖刺激后的各组细胞胰岛素分泌功能。结果:克隆的pawr基因片段测序正确。高纯度质粒中量抽提试剂盒抽提重组腺病毒载体质粒成功,单酶切鉴定,质粒转染HEK293细胞后有GFP表达,扩增48 h后出现细胞病变效应,病毒滴度测定为1×109 pfu/ml,低糖和高糖过表达PAR-4后均较相应对照组PAR-4表达明显升高,高糖培养+过表达PAR-4组细胞增殖能力均较低糖(P=0.000)和高糖对照组细胞(P=0.000)明显下降,较低糖(P=0.003)和高糖对照组细胞(P=0.001)胰岛素分泌明显下降。结论:成功构建高滴度pawr基因表达的重组腺病毒载体并转染NIT-1细胞,转染PAR-4后高糖培养的NIT-1细胞增殖能力和胰岛素分泌功能明显下降。
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