论文部分内容阅读
背景:已往研究显示,心肌对短暂缺血再灌的应答与多种基因表达改变有关,但它们的特性尚未明确。目的:克隆和分析应力可诱导基因特性以探讨心肌短暂缺血再灌损伤的分子机制。设计:对比观察的动物实验。单位:中南大学湘雅医院血液科。材料:选用16只健康德国Landrace家猪,体质量21～39kg,由德国巴特瑙海姆马普所生理与临床研究所实验心脏病学研究室提供。对家猪的处置遵循美国生理学会的规章。按随机数字表法将16只家猪分为缺血再灌注手术组(n=14)和假手术组(n=2)。缺血再灌注组动物在第二次缺血再灌注后0,30,90min3个时间点进行观察。每组又分为缺血组织和对照组织两部分。方法:实验于1998-07/2007-05分别在德国巴特瑙海姆马普生理与临床研究所实验心脏病学研究室和中南大学湘雅医院血液科完成。将动物麻醉后,开胸,稳定30min后,缺血再灌注组动物阻塞左冠状动脉前降支10min,灌注30min,再次阻塞10min,时间点为(10’-30’-10’),再灌注30min(时间点为10’-30’-10’-30’);再灌注90min(时间点为10’-30’-10’-90’)后取心肌组织。假手术组不进行缺血再灌注。按预定观察时间点将动物分别麻醉后处死,取左冠状动脉前降支区域的组织作为缺血组织,左冠状动脉弦支区域的组织作为对照组织。首先,以cDNA片段RKD7.1作为探针筛选猪心脏cDNA文库并通过DNA序列测定分析所克隆基因的DNA序列。同时,通过短暂阻断和再灌注猪左冠状动脉前降支形成缺血再灌心肌。然后,从该缺血再灌猪心肌组织提取总RNA后用于Northern杂交分析,以基因杂交后灰度值与其18SrRNA灰度值的比值作为基因表达的相对水平。主要观察指标:克隆基因DNA和氨基酸序列分析及克隆基因表达分析。结果:16只健康德国Landrace家猪均进入结果分析。通过筛选文库,克隆到一个含有3461个碱基对的cDNA。DNA序列测定和检索分析显示该cDNA与可能编码DNA修复蛋白的人类染色体结构维持基因6具有86%的相同性,并与鼠染色体结构维持基因6具有84%的相同性。进一步分析发现,由此cDNA推导出的最长多肽链含有1007个氨基酸残基,它与人类染色体结构维持基因6蛋白具有92%相同性,与鼠染色体结构维持基因6蛋白具有89%相同性。为此,该cDNA取名为人类染色体结构维持基因6猪同源基因。Northern杂交结果显示,猪染色体结构维持基因6mRNA在缺血再灌心肌的表达为增加并且其mRNA在所检测的各种器官中均存在达。结论:从猪心肌克隆到一个应力可诱导猪染色体结构维持基因6,它与人类染色体结构维持基因6具有高度的同源性,猪染色体结构维持基因6或者与其他分子可能共同参与缺血再灌所致猪心肌DNA损伤的早期修复。