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【摘要】目的：探讨磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在人参皂苷Rg1 （ginsenoside Rg1）诱导人红白血病细胞（K562）衰老中的作用机制。方法：将K562分为实验组和对照组，实验组加入20 μmol·Lˉ?的人参皂苷Rg1，对照组加入等量的PBS。使用CCK-8试剂盒检测K562的增殖能力;使用SA-β-gal染色检测细胞衰老情况、western blotting检测端粒酶逆转录酶（hTERT）活性以确定K562细胞衰老生物学改变，荧光定量PCR检测PI3K，Akt和mTOR mRNA表达改变，western blotting 检测PI3K、p - Akt、p - mTOR和自噬调控因子微管轻链I蛋白3-II型（LC3II）蛋白表达的改变。结果：人参皂苷Rg1诱导后，K562细胞增殖抑制率增高，K562的增殖能力下降（P<0.05），SA-β-gal染色显示衰老细胞较对照组明显增多，阳性率增高（P<0.05），端粒酶hTERT蛋白表达水平下调（P<0.05），K562细胞呈现衰老生物学改变;自噬调控因子LC3II蛋白表达下调（P<0.05）与对照组比较，实验组K652细胞PI3K，Akt和mTOR mRNA表达上调（P<0.05），PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达上调（P<0.001）。结论： 人参皂苷Rg1可通过激活PI3K /Akt / mTOR信号通路诱导K562细胞衰老。
【关键词】K562;衰老;人参皂苷Rg1;PI3K;Akt;mTOR
【中图分类号】R733.7 【文献标识码】A 【文章编号】2026-5328（2021）08-014-03
白血病 （leukemia） 是多能造血干细胞异常增殖形成的恶性血液系统疾病，病因复杂多样，目前化疗药物治疗是临床白血病治疗的主要方法，但化疗药物在杀伤白血病细胞的同时也损伤机体正常血细胞[1，2]。许多天然药物在抗白血病细胞同时具有保护正常细胞的优点，因此，对中药活性成分的探究并从其中寻找治疗白血病的有效药物是值得探索的途径之一。
据报道，人參皂苷Rg1在体外可有效抑制白血病K562细胞增殖[3，4]，促进肿瘤细胞凋亡[5]。现下对人参皂苷Rg1的作用机制研究大多针对促进肿瘤细胞凋亡，但却很少有研究报道Rg1诱导白血病细胞衰老的作用机制。本研究以人慢性粒细胞白血病K562细胞为对象，探讨人参皂苷Rg1通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导K562细胞衰老的机制。
1.材料
2.K562细胞、RPMI培养基（HyClone公司）;胎牛血清（BI公司）;人参皂苷Rg1（大连美仑生物有限公司，纯度>95%）;CCK-8试剂盒、SA-β-Gal Staining Kit （ Cell Signaling 公司）;，PCR 引物（ Invitrogen 公司）;荧光定量PCR试剂盒（TaKaRa 公司））;抗体（Santa Cruz 公司）;蛋白裂解液（ Applygen公司），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）。
2.分组
实验组：取对数生长期K562细胞加入20 μmol·Lˉ? 的人参皂苷Rg1。对照组：加入与实验组药物等量的PBS。置于37 ℃、含5% CO2 的培养箱中培养。
3.K562细胞衰老相关生物学检测
3.1 CCK-8法检测细胞增殖能力
将K562细胞重悬后，按1×105个/ml的浓度将K562细胞接种于96孔板，每孔100 μL，每组设5个复孔。实验组加入20 μmol·Lˉ?人参皂苷Rg1，每孔10 μL;对照组加入10 μL PBS，共培养48 后，每孔加入10 μL CCK-8，孵育4 h后，酶标仪检测A450值。细胞增殖抑制率（%）=（对照组A450平均值-实验组A450平均值）/对照组A450平均值×100%。
3.2 SA-β-Gal衰老染色
将K562细胞重悬后，取1×105 个K562细胞置于50 c㎡的培养瓶中，加入 RPMI 1640培养基至5 mL。实验组和对照组分别加入20 μmol·Lˉ?人参皂苷Rg1和PBS 各500 μL，培养48 h后离心收集两组细胞，PBS洗涤2次，按照SA-β-Gal Staining Kit 方法操作，染色细胞孵育12h后显微镜下进行计数。
3.3 端粒酶逆转录酶（hTERT）活性检测
收集两组细胞，PBS洗涤2次，提取各组细胞总蛋白，按BCA蛋白浓度测定试剂盒方法测定总蛋白浓度，取等量总蛋白经 SDS-PAGE 电泳分离后转移至PVDF 膜，5% 脱脂奶粉封闭 2h，加入兔抗鼠hTERT一抗（ 1∶200），4℃ 过夜，TBST 缓冲液漂洗2次，加入HRP标记的羊抗兔二抗 （1∶5000），室温反应 2h，TBST洗膜3次，CL增强发光试剂显色，凝胶成像系统曝光，显影定影后观察结果。
3.4 荧光定量PCR检测PI3K，Akt和mTOR mRNA的表达
收集两组细胞，Trizol裂解后，分别提取各组细胞总RNA，反转录为DNA，反转录反应条件：30℃，10min，42℃，30min，95℃，5min;以RNA反转录得到的cDNA为模板，扩增PI3K，Akt和mTOR，以 GAPDH 为内参照。引物序列见表1。扩增条件：50℃ 2min; 95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环。 应用Quantity One 4. 6. 2 软件（ Bio Rad公司） 进行数据处理，分析结果。
3.5 western blotting 检测PI3K、p-Akt、p-mTOR和自噬调控因子LC3II蛋白表达 收集两组细胞，PBS洗涤2次，提取各组细胞总蛋白，按BCA蛋白浓度测定试剂盒方法测定总蛋白浓度，取等量總蛋白经SDS-PAGE电泳分离后转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭2h，加入兔抗鼠PI3K、p-Akt、p-mTOR、LC3II一抗（ 1∶200），4℃过夜，TBST缓冲液漂洗2次，加入HRP标记的羊抗兔二抗（ 1∶5000），室温反应 2h，TBST洗膜3次，ECL增强发光试剂显色，凝胶成像系统曝光，显影定影后观察结果。
3.6 统计学分析
运用 SPSS 18.0统计学软件进行实验数据处理，采用单因素方差分析方法，结果以均值±标准差（）表示，P<0.05表明差异有统计学意义。
结果
1. 人参皂苷Rg1对K562细胞增殖的影响
实验组K562经20 μmol·Lˉ?人参皂苷Rg1处理48 h后，抑制率为（35.23±0.26）;与对照组相比，实验组K562细胞增殖抑制率升高，细胞增殖能力下降，差异有统计学意义（P <0.05）。
2. Rg1对K562细胞SA-β-Gal染色阳性率的影响
K562细胞经不同组处理48h后，与对照组比较，实验组K562细胞SA-β-Gal染色阳性率增高（见表2），差异有统计学意义。（P<0.05）。
3.人参皂苷Rg1对K562细胞hTERT活性的影响
对照组hTERT蛋白表达为65.220±1.611%，实验组hTERT蛋白表达为21.117±1.166 %（P<0.01）;与对照组比较，实验组K562细胞hTERT蛋白表达下调。
4. 人参皂苷Rg1对K562细胞自噬因子LC3Ⅱ表达的影响
对照组K562细胞自噬因子LC3II表达量为30.477±0.828 %，实验组LC3II表达量为18.790±2.305 %;与对照组比较，Rg1组K562细胞LC3II蛋白表达明显下调（P<0.05）。
5. 人参皂苷Rg1对K562细胞PI3K、Akt和mTOR mRNA表达的影响
经过浓度为20 μmol·L-1的人参皂苷Rg1作用48h，与对照组比较，Rg1组K562细胞PI3K、Akt和mTOR mRNA表达水平明显上调（见表3）。
6. 人参皂苷Rg1对K562细胞PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达的影响
与对照组比较，Rg1组K562细胞PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平上调（见表4）
讨论
白血病是一类由造血干细胞恶性克隆形成的疾病，白血病的传统治疗包括骨髓移植和化疗，骨髓移植供体来源缺，治疗费用昂贵，化疗副作用大，特异性差，且化疗药物在杀伤白血病细胞的同时也对机体正常细胞起到损伤的作用，探寻既能杀灭白血病细胞又能保护正常血液细胞的调控剂是白血病治疗研究的新策略。
人参是祖国医学“补气活血”的君药，具有生血，补气，抗衰老，抗肿瘤的功效，Rg1对白血病K562细胞具有抑制增殖分化的功能。据报道，K562细胞与5、10、20、40、80μmol·Lˉ?剂量的人参皂苷共培养24、48、72h后，20 μmol·Lˉ?人参皂苷Rgl与K562细胞共培养48 h 时，对K562细胞增殖抑制作用最强。[6]Rg1能否通过诱导K562细胞衰老达到抑制白血病的作用是本文着重关注的问题。
细胞异常增殖是肿瘤的基本特征之一，细胞衰老是抑制增殖的重要机制，检测肿瘤细胞增殖能力是评价肿瘤发生发展和肿瘤细胞衰老程度的重要指标。衰老的细胞内SA-β-Gal活性上调，与X-Gal反应后在显微镜下呈现深蓝色，是鉴定细胞衰老的重要标识。端粒-端粒酶系统与细胞增殖和衰老有关，端粒酶的高表达可使细胞永生化，进而引起肿瘤无限增殖;衰老细胞端粒长度缩短，端粒酶活性下降hTERT与端粒酶活性呈正相关[7]。本研究将Rg1体外作用于K562细胞，结果显示，Rg1诱导后K562细胞增殖能力显著下降，SA-β-Gal染色阳性细胞数量增多，hTERT活性显著下降，这些改变与细胞衰老的生物学变化一致，提示Rg1可在体外诱导K562细胞衰老。
自噬通过清除氧自由基和受损细胞器及诱导细胞程序性死亡，来维持内环境稳态和基因组稳定，抑制肿瘤发生、发展;同时细胞通过自噬清除其损伤的细胞器或错误折叠蛋白发挥调控细胞衰老的功能，细胞自噬水平下降可加速细胞衰老的发生。LC3-II的含量的多少与自噬体数量的多少呈正比，是反映自噬强度的指标。Rg1诱导后K562细胞PI3K，Akt和mTOR mRNA表达上调，PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达上调，说明Rg1可通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路而抑制细胞自噬，自噬调控分子LC3-II的表达下调，从而在诱导细胞衰老中发挥重要的调控作用。
【参考文献】
[1]Roeker L E，Dreger P，Brown J R，et al. Allogeneic stem cell transplantation for chronic lymphocytic leukemia in the era of novel agents[J]. Blood Adv，2020，4（16）：3977-3989.
[2]Sherief L M，Goneim E，Kamal N M，et al. Acute lymphoblastic leukemia in a beta-thalassemia intermedia child：A case report[J]. World J Clin Pediatr，2020，9（1）：1-6.
[3]Chu S F，Zhang Z，Zhou X，et al. Ginsenoside Rg1 protects against ischemic/reperfusion-induced neuronal injury through miR-144/Nrf2/ARE pathway[J]. Acta Pharmacol Sin，2019，40（1）：13-25.
[4]Luo M，Yan D，Sun Q，et al. Ginsenoside Rg1 attenuates cardiomyocyte apoptosis and inflammation via the TLR4/NF-kB/NLRP3 pathway[J]. J Cell Biochem，2020，121（4）：2994-3004.
[5]Li J，Wei Q，Zuo G W，et al. Ginsenoside Rg1 induces apoptosis through inhibition of the EpoR-mediated JAK2/STAT5 signalling pathway in the TF-1/ Epo human leukemia cell line[J]. Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（6）：2453-2459.
[6]韩艳军，王翠丽，刘小虎，等. 人参皂苷Rg1对K562细胞增殖的影响[J]. 大理大学学报，2020，5：16-20.
[7]Aref S，El A M，El S A，et al. Prognostic Value of CD200 Expression and Soluble CTLA-4 Concentrations in Intermediate and High-Risk Myelodysplastic Syndrome Patients[J]. Asian Pac J Cancer Prev，2020，21（8）：2225-2230.
[基金项目]国家自然科学基金（81860038;81660731;81873103）
[第一作者]周雯，硕士生，从事中药药理学相关研究，
[通讯作者]*周玥，博士，教授，硕士生导师，研究方向为中药药理学
【关键词】K562;衰老;人参皂苷Rg1;PI3K;Akt;mTOR
【中图分类号】R733.7 【文献标识码】A 【文章编号】2026-5328（2021）08-014-03
白血病 （leukemia） 是多能造血干细胞异常增殖形成的恶性血液系统疾病，病因复杂多样，目前化疗药物治疗是临床白血病治疗的主要方法，但化疗药物在杀伤白血病细胞的同时也损伤机体正常血细胞[1，2]。许多天然药物在抗白血病细胞同时具有保护正常细胞的优点，因此，对中药活性成分的探究并从其中寻找治疗白血病的有效药物是值得探索的途径之一。
据报道，人參皂苷Rg1在体外可有效抑制白血病K562细胞增殖[3，4]，促进肿瘤细胞凋亡[5]。现下对人参皂苷Rg1的作用机制研究大多针对促进肿瘤细胞凋亡，但却很少有研究报道Rg1诱导白血病细胞衰老的作用机制。本研究以人慢性粒细胞白血病K562细胞为对象，探讨人参皂苷Rg1通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导K562细胞衰老的机制。
1.材料
2.K562细胞、RPMI培养基（HyClone公司）;胎牛血清（BI公司）;人参皂苷Rg1（大连美仑生物有限公司，纯度>95%）;CCK-8试剂盒、SA-β-Gal Staining Kit （ Cell Signaling 公司）;，PCR 引物（ Invitrogen 公司）;荧光定量PCR试剂盒（TaKaRa 公司））;抗体（Santa Cruz 公司）;蛋白裂解液（ Applygen公司），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）。
2.分组
实验组：取对数生长期K562细胞加入20 μmol·Lˉ? 的人参皂苷Rg1。对照组：加入与实验组药物等量的PBS。置于37 ℃、含5% CO2 的培养箱中培养。
3.K562细胞衰老相关生物学检测
3.1 CCK-8法检测细胞增殖能力
将K562细胞重悬后，按1×105个/ml的浓度将K562细胞接种于96孔板，每孔100 μL，每组设5个复孔。实验组加入20 μmol·Lˉ?人参皂苷Rg1，每孔10 μL;对照组加入10 μL PBS，共培养48 后，每孔加入10 μL CCK-8，孵育4 h后，酶标仪检测A450值。细胞增殖抑制率（%）=（对照组A450平均值-实验组A450平均值）/对照组A450平均值×100%。
3.2 SA-β-Gal衰老染色
将K562细胞重悬后，取1×105 个K562细胞置于50 c㎡的培养瓶中，加入 RPMI 1640培养基至5 mL。实验组和对照组分别加入20 μmol·Lˉ?人参皂苷Rg1和PBS 各500 μL，培养48 h后离心收集两组细胞，PBS洗涤2次，按照SA-β-Gal Staining Kit 方法操作，染色细胞孵育12h后显微镜下进行计数。
3.3 端粒酶逆转录酶（hTERT）活性检测
收集两组细胞，PBS洗涤2次，提取各组细胞总蛋白，按BCA蛋白浓度测定试剂盒方法测定总蛋白浓度，取等量总蛋白经 SDS-PAGE 电泳分离后转移至PVDF 膜，5% 脱脂奶粉封闭 2h，加入兔抗鼠hTERT一抗（ 1∶200），4℃ 过夜，TBST 缓冲液漂洗2次，加入HRP标记的羊抗兔二抗 （1∶5000），室温反应 2h，TBST洗膜3次，CL增强发光试剂显色，凝胶成像系统曝光，显影定影后观察结果。
3.4 荧光定量PCR检测PI3K，Akt和mTOR mRNA的表达
收集两组细胞，Trizol裂解后，分别提取各组细胞总RNA，反转录为DNA，反转录反应条件：30℃，10min，42℃，30min，95℃，5min;以RNA反转录得到的cDNA为模板，扩增PI3K，Akt和mTOR，以 GAPDH 为内参照。引物序列见表1。扩增条件：50℃ 2min; 95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环。 应用Quantity One 4. 6. 2 软件（ Bio Rad公司） 进行数据处理，分析结果。
3.5 western blotting 检测PI3K、p-Akt、p-mTOR和自噬调控因子LC3II蛋白表达 收集两组细胞，PBS洗涤2次，提取各组细胞总蛋白，按BCA蛋白浓度测定试剂盒方法测定总蛋白浓度，取等量總蛋白经SDS-PAGE电泳分离后转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭2h，加入兔抗鼠PI3K、p-Akt、p-mTOR、LC3II一抗（ 1∶200），4℃过夜，TBST缓冲液漂洗2次，加入HRP标记的羊抗兔二抗（ 1∶5000），室温反应 2h，TBST洗膜3次，ECL增强发光试剂显色，凝胶成像系统曝光，显影定影后观察结果。
3.6 统计学分析
运用 SPSS 18.0统计学软件进行实验数据处理，采用单因素方差分析方法，结果以均值±标准差（）表示，P<0.05表明差异有统计学意义。
结果
1. 人参皂苷Rg1对K562细胞增殖的影响
实验组K562经20 μmol·Lˉ?人参皂苷Rg1处理48 h后，抑制率为（35.23±0.26）;与对照组相比，实验组K562细胞增殖抑制率升高，细胞增殖能力下降，差异有统计学意义（P <0.05）。
2. Rg1对K562细胞SA-β-Gal染色阳性率的影响
K562细胞经不同组处理48h后，与对照组比较，实验组K562细胞SA-β-Gal染色阳性率增高（见表2），差异有统计学意义。（P<0.05）。
3.人参皂苷Rg1对K562细胞hTERT活性的影响
对照组hTERT蛋白表达为65.220±1.611%，实验组hTERT蛋白表达为21.117±1.166 %（P<0.01）;与对照组比较，实验组K562细胞hTERT蛋白表达下调。
4. 人参皂苷Rg1对K562细胞自噬因子LC3Ⅱ表达的影响
对照组K562细胞自噬因子LC3II表达量为30.477±0.828 %，实验组LC3II表达量为18.790±2.305 %;与对照组比较，Rg1组K562细胞LC3II蛋白表达明显下调（P<0.05）。
5. 人参皂苷Rg1对K562细胞PI3K、Akt和mTOR mRNA表达的影响
经过浓度为20 μmol·L-1的人参皂苷Rg1作用48h，与对照组比较，Rg1组K562细胞PI3K、Akt和mTOR mRNA表达水平明显上调（见表3）。
6. 人参皂苷Rg1对K562细胞PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达的影响
与对照组比较，Rg1组K562细胞PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平上调（见表4）
讨论
白血病是一类由造血干细胞恶性克隆形成的疾病，白血病的传统治疗包括骨髓移植和化疗，骨髓移植供体来源缺，治疗费用昂贵，化疗副作用大，特异性差，且化疗药物在杀伤白血病细胞的同时也对机体正常细胞起到损伤的作用，探寻既能杀灭白血病细胞又能保护正常血液细胞的调控剂是白血病治疗研究的新策略。
人参是祖国医学“补气活血”的君药，具有生血，补气，抗衰老，抗肿瘤的功效，Rg1对白血病K562细胞具有抑制增殖分化的功能。据报道，K562细胞与5、10、20、40、80μmol·Lˉ?剂量的人参皂苷共培养24、48、72h后，20 μmol·Lˉ?人参皂苷Rgl与K562细胞共培养48 h 时，对K562细胞增殖抑制作用最强。[6]Rg1能否通过诱导K562细胞衰老达到抑制白血病的作用是本文着重关注的问题。
细胞异常增殖是肿瘤的基本特征之一，细胞衰老是抑制增殖的重要机制，检测肿瘤细胞增殖能力是评价肿瘤发生发展和肿瘤细胞衰老程度的重要指标。衰老的细胞内SA-β-Gal活性上调，与X-Gal反应后在显微镜下呈现深蓝色，是鉴定细胞衰老的重要标识。端粒-端粒酶系统与细胞增殖和衰老有关，端粒酶的高表达可使细胞永生化，进而引起肿瘤无限增殖;衰老细胞端粒长度缩短，端粒酶活性下降hTERT与端粒酶活性呈正相关[7]。本研究将Rg1体外作用于K562细胞，结果显示，Rg1诱导后K562细胞增殖能力显著下降，SA-β-Gal染色阳性细胞数量增多，hTERT活性显著下降，这些改变与细胞衰老的生物学变化一致，提示Rg1可在体外诱导K562细胞衰老。
自噬通过清除氧自由基和受损细胞器及诱导细胞程序性死亡，来维持内环境稳态和基因组稳定，抑制肿瘤发生、发展;同时细胞通过自噬清除其损伤的细胞器或错误折叠蛋白发挥调控细胞衰老的功能，细胞自噬水平下降可加速细胞衰老的发生。LC3-II的含量的多少与自噬体数量的多少呈正比，是反映自噬强度的指标。Rg1诱导后K562细胞PI3K，Akt和mTOR mRNA表达上调，PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达上调，说明Rg1可通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路而抑制细胞自噬，自噬调控分子LC3-II的表达下调，从而在诱导细胞衰老中发挥重要的调控作用。
【参考文献】
[1]Roeker L E，Dreger P，Brown J R，et al. Allogeneic stem cell transplantation for chronic lymphocytic leukemia in the era of novel agents[J]. Blood Adv，2020，4（16）：3977-3989.
[2]Sherief L M，Goneim E，Kamal N M，et al. Acute lymphoblastic leukemia in a beta-thalassemia intermedia child：A case report[J]. World J Clin Pediatr，2020，9（1）：1-6.
[3]Chu S F，Zhang Z，Zhou X，et al. Ginsenoside Rg1 protects against ischemic/reperfusion-induced neuronal injury through miR-144/Nrf2/ARE pathway[J]. Acta Pharmacol Sin，2019，40（1）：13-25.
[4]Luo M，Yan D，Sun Q，et al. Ginsenoside Rg1 attenuates cardiomyocyte apoptosis and inflammation via the TLR4/NF-kB/NLRP3 pathway[J]. J Cell Biochem，2020，121（4）：2994-3004.
[5]Li J，Wei Q，Zuo G W，et al. Ginsenoside Rg1 induces apoptosis through inhibition of the EpoR-mediated JAK2/STAT5 signalling pathway in the TF-1/ Epo human leukemia cell line[J]. Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（6）：2453-2459.
[6]韩艳军，王翠丽，刘小虎，等. 人参皂苷Rg1对K562细胞增殖的影响[J]. 大理大学学报，2020，5：16-20.
[7]Aref S，El A M，El S A，et al. Prognostic Value of CD200 Expression and Soluble CTLA-4 Concentrations in Intermediate and High-Risk Myelodysplastic Syndrome Patients[J]. Asian Pac J Cancer Prev，2020，21（8）：2225-2230.
[基金项目]国家自然科学基金（81860038;81660731;81873103）
[第一作者]周雯，硕士生，从事中药药理学相关研究，
[通讯作者]*周玥，博士，教授，硕士生导师，研究方向为中药药理学