论文部分内容阅读
摘 要：为了解银杏叶多糖对发酵乳品质及其抗氧化活性的影响，采用水提法从银杏叶中提取多糖，研究不同银杏叶多糖溶液浓度（0%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、025%）對1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）和羟基自由基（·OH）清除的能力。结果表明：银杏叶多糖溶液在浓度为3.0mg/mL对DPPH的清除率为58.8%，在浓度为2.5mg/mL对·OH的清除率为61.3%，说明银杏叶多糖有较好的抗氧化性，可进行加工开发利用。
关键词：银杏叶;多糖;抗氧化活性
中图分类号 R284 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）09-0027-03
Abstract： In order to study the effect of Ginkgo biloba polysaccharide on the quality of fermented milk and its antioxidant activity， the polysaccharide was extracted by water extraction and alcohol precipitation， The scavenging ability of 1， 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical （DPPH） and hydroxyl radical （·OH） at 0%， 0.05%， 0.10%， 0.15%， 0.20% and 025% concentration of Ginkgo biloba polysaccharide solution was studied.The results showed that the scavenging rate of DPPH free radical was 58.8% at the concentration of 3.0mg/mL， and the scavenging rate of OH- free radical was 61.3% at the concentration of 2.5mg/mL， which indicated that Ginkgo biloba polysaccharides had good antioxidant activity， which could provide a basis for the development and utilization of Ginkgo biloba leaves.
Key words： Ginkgo biloba; Polysaccharide; Antioxidant activity.
银杏（Ginkgo Biloba L.），是一种裸子植物，具有很高的药物食用价值。在生物演化史上被称为“活化石”，喜欢生长在沙壤土中。银杏叶多糖的主要活性化学成分为黄酮类、萜内脂、聚戊烯醇、有机酸、花青素和多糖类化合物，具有较好的药学功能，能帮助人们活血和止疼，还有降脂的功能[1]。银杏叶多糖（GBEP）主要成分是萜内酯、黄酮类等具有活性功能的化学成分，其对自由基有清除作用，具有延缓衰老、扩张脑血管、改善毛细血管促进血液循环等作用。最新的研究表明，GBEP对人急性早幼粒白血病细胞增殖也有抑制作用，抑制癌细胞的增殖[2]。GBEP具有广阔的发展前景，因此，笔者对银杏多糖进行了深入研究，分析其抗氧化性[3]。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂 银杏叶：购自学校校医室;DPPH、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、无水乙醇均来自天津航科科技公司，试验用水均为蒸馏水。
1.2 仪器与设备 BSA124S电子分析天平：赛多利斯科技有限公司;HS电热鼓风干燥箱：苏州达瑞电热有限公司;UV-670紫外-可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司;SGZ离心机：长沙东旺实验仪器有限公司
1.3 方法
1.3.1 银杏叶多糖的提取 将清洗过的新鲜银杏叶风干、粉碎，准确称取1g的样品置于烧杯中，将装有样品的烧杯放入60℃恒温锅，向烧杯中加入30g水搅拌溶解。将溶解后的粗体液在放入高速离心机中，8000r/min下离心25min，重复3次，合并3次上清液。将上清液加入乙醇，沉淀即为多糖，装入真空盘中，用真空干燥进行浓缩。
1.3.2 银杏叶多糖含量的测定 银杏叶多糖的含量的测定可以利用苯酚-硫酸法。取1.0mL银杏叶多糖溶液，加蒸馏水定容至2mL，再加入1mL的苯酚，混匀后，快速向其中加入5mL的浓硫酸，立即摇匀，放置30min后在490nm处测定其吸光度[3]。
1.3.3 银杏叶多糖抗氧化性的测定
1.3.3.1 ·OH清除能力 将提前配好的95%乙醇放入比色管中，在一定浓度的1mL样品溶液放入比色管测定，其吸光度为A1。蒸馏水1mL放入另一种空白管中作为对照，其吸光度为A0。分别加入硫酸亚铁溶液和H2O2溶液各5mL，放入漩涡混合器旋涡3min，再加入已经配好的3mmol/L水杨酸溶液定容至刻度，立刻放入预热好的37℃的恒温水中反应15min后，分别在510nm下的波长下，记录各自的吸光度值，将各值代入公式计算，分别平行做三次实验。按如下公式计算清除率[4]：
式中：A0—以蒸馏水代替待测液所得的吸光度;A1—样品液与H2O2反应后测得的吸光度;A2—水代替H2O2溶液测得的吸光度。
1.3.3.2 清除DPPH能力 DPPH自由基具有单电子，在可见光520nm处有很强的吸收光谱，其颜色是典型的紫色。在DPPH溶液中把银杏叶多糖清除剂加入，当其把里面的自由基清除掉以后，会使先前的溶液由紫色向黄色或无色变化，吸收值也会相应减小，银杏叶多糖清除剂能使单电子配对，在520nm用分光光度计进行测量定时，吸光度值也相应减少，溶液褪色。这种变化使其接受电子数量成定量关系，因此可以用这种方法测定。检测不同浓度的银杏叶多糖对DPPH的清除能力，以相同浓度VC溶液作阳性对照，计算DPPH的清除率[5-6]。 取1mL0.1mmoL/L的DPPH乙醇溶液于比色管中，分别加入2mL不同比例浓度的多糖样品液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL），摇匀，暗处静置30min后于520nm条件下测其吸光度。以VC做阳性对照组，计算DPPH的清除率。DPPH清除率的计算公式如下[7-8]：
式中：A0—蒸馏水与DPPH混合后的吸光度;A1—样品液与DPPH溶液混合后的吸光度;A2—样品液与蒸馏水混合后的吸光度。
2 结果与分析
2.1 银杏叶多糖的含量 如图1所示，求得线性回归方程即为葡萄糖的标准曲线，曲线方程为Y=1.3137X+0.2795，（R2=0.9824）。经检测银杏叶多糖的含量为5.52%。实验结果较李化强、吴菲菲等人测得的银杏叶粗多糖的结果稍大[3]，原因可能是利用水提醇沉法提取的银杏叶多糖中含有少量蛋白质、脂肪等物质。
2.2 银杏叶多糖的抗氧化性
2.2.1 对DPPH的清除作用 由图2可知银杏叶多糖溶液的浓度差影响着DPPH的清除能力。银杏叶多糖溶液浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL时，对DPPH的清除率分别为23.4%、28.2%、30.8%、42.7%、52.9%、58.6%。当银杏叶的多糖浓度大于1.5mg/mL时，对DPPH的清除率显著升高。说明当银杏叶多糖的浓度增大时，对DPPH的清除能力也增强。相同溶液浓度下，以VC溶液作为阳性对照，对DPPH的清除率为82.9%、87.4%、88.2%、90.8%、92.6%、95.4%。说明阳性对照VC对DPPH也具有较好的清除作用。
2.2.2 对·OH的清除作用 羟自由基系活性氧一种，是人体内目前所知活性强，寿命短的自由基。可使细胞膜被破坏，血清抗蛋白酶失去活性，損伤基因导致细胞变异的出现和蓄积，从而导致疾病的发生，严重者会对基因造成破坏，导致机体发生系统紊乱。加入自由基清除剂后其破坏明显降低，以Vc做阳性对照，研究制备的不同浓度的银杏叶多糖溶液对·OH的清除作用，结果如图3所示。
由图3可知，银杏叶多糖溶液在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL时，对·OH的清除率分别为17.7%、39.0%、48.8%、51.9%、61.3%、59.5%。当银杏叶多糖浓度在2.5mg/mL时，其清除率为61.3%，而当银杏叶多糖浓度在3.0mg/mL时，清除率却有所下降，为59.5%。原因可能是使用紫外分光光度计检测时造成了误差。阳性对照VC在浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL时，·OH的清除率分别为72.9%、77.8%、82.8%、87.4%、89.7%、95.3%。可以看出阳性对照VC具有很好的抗氧化性。
3 结论与讨论
利用水提醇沉的方法提取银杏叶中的多糖，研究不同浓度银杏叶多糖的抗氧化性。结果表明，银杏叶多糖浓度在0～3mg/mL内，当浓度增加时，对DPPH的清除能力在逐渐增大，·OH的清除率也在逐渐增高，表明银杏叶多糖具有良好的抗氧化活性，但银杏叶多糖对DPPH的清除率明显低于VC，这与许春雨的研究结果一致[5]。
参考文献
[1]杨电增，邹兰兰，钱志伟.马齿苋多糖双酶法提取工艺优化及其抗氧化性研究[J].保鲜与加工，2021，21（02）：88-93.
[2]陈群，刘天骄.银杏叶多糖的抗肿瘤和免疫调节作用[J].中药药理与临床，2003.19（5）：18-19.
[3]杨俊游.银杏叶多糖提取、纯化及其含量的测定[J]海南医学院学报，2013，19（6）：735-737.
[4]张瑾，王文婷，王国霞.银杏外种皮及银杏叶提取液对冬枣保鲜的影响研究[J].宁夏农林科技，2018，59（07）：55-57.
[5]芦莲，戴余军，李长春.银杏叶多糖提取工艺的研究[J].中国酿造，2012，31（10）：106-108.
[6]Om P. Sharma，Tej K. Bhat. DPPH antioxidant assay revisited[J]. Food Chemistry，2009，113（4）：1202–1205.
[7]邓加聪，曾锈华，陈婕，郭婷婷，王志辉，郑虹.牛肝菌多糖的提取及抗氧化性研究[J].中国酿造，2019，38（10）：158-161.
[8]冯书珍，卢宇凤，刘南英，徐畅，谢广燕，冯学珍.海藻多糖的单糖组成对体外抗氧化活性的影响[J].天然产物研究与开发，2019，31（01）：116-121+169.
（责编：王慧晴）
关键词：银杏叶;多糖;抗氧化活性
中图分类号 R284 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）09-0027-03
Abstract： In order to study the effect of Ginkgo biloba polysaccharide on the quality of fermented milk and its antioxidant activity， the polysaccharide was extracted by water extraction and alcohol precipitation， The scavenging ability of 1， 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical （DPPH） and hydroxyl radical （·OH） at 0%， 0.05%， 0.10%， 0.15%， 0.20% and 025% concentration of Ginkgo biloba polysaccharide solution was studied.The results showed that the scavenging rate of DPPH free radical was 58.8% at the concentration of 3.0mg/mL， and the scavenging rate of OH- free radical was 61.3% at the concentration of 2.5mg/mL， which indicated that Ginkgo biloba polysaccharides had good antioxidant activity， which could provide a basis for the development and utilization of Ginkgo biloba leaves.
Key words： Ginkgo biloba; Polysaccharide; Antioxidant activity.
银杏（Ginkgo Biloba L.），是一种裸子植物，具有很高的药物食用价值。在生物演化史上被称为“活化石”，喜欢生长在沙壤土中。银杏叶多糖的主要活性化学成分为黄酮类、萜内脂、聚戊烯醇、有机酸、花青素和多糖类化合物，具有较好的药学功能，能帮助人们活血和止疼，还有降脂的功能[1]。银杏叶多糖（GBEP）主要成分是萜内酯、黄酮类等具有活性功能的化学成分，其对自由基有清除作用，具有延缓衰老、扩张脑血管、改善毛细血管促进血液循环等作用。最新的研究表明，GBEP对人急性早幼粒白血病细胞增殖也有抑制作用，抑制癌细胞的增殖[2]。GBEP具有广阔的发展前景，因此，笔者对银杏多糖进行了深入研究，分析其抗氧化性[3]。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂 银杏叶：购自学校校医室;DPPH、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、无水乙醇均来自天津航科科技公司，试验用水均为蒸馏水。
1.2 仪器与设备 BSA124S电子分析天平：赛多利斯科技有限公司;HS电热鼓风干燥箱：苏州达瑞电热有限公司;UV-670紫外-可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司;SGZ离心机：长沙东旺实验仪器有限公司
1.3 方法
1.3.1 银杏叶多糖的提取 将清洗过的新鲜银杏叶风干、粉碎，准确称取1g的样品置于烧杯中，将装有样品的烧杯放入60℃恒温锅，向烧杯中加入30g水搅拌溶解。将溶解后的粗体液在放入高速离心机中，8000r/min下离心25min，重复3次，合并3次上清液。将上清液加入乙醇，沉淀即为多糖，装入真空盘中，用真空干燥进行浓缩。
1.3.2 银杏叶多糖含量的测定 银杏叶多糖的含量的测定可以利用苯酚-硫酸法。取1.0mL银杏叶多糖溶液，加蒸馏水定容至2mL，再加入1mL的苯酚，混匀后，快速向其中加入5mL的浓硫酸，立即摇匀，放置30min后在490nm处测定其吸光度[3]。
1.3.3 银杏叶多糖抗氧化性的测定
1.3.3.1 ·OH清除能力 将提前配好的95%乙醇放入比色管中，在一定浓度的1mL样品溶液放入比色管测定，其吸光度为A1。蒸馏水1mL放入另一种空白管中作为对照，其吸光度为A0。分别加入硫酸亚铁溶液和H2O2溶液各5mL，放入漩涡混合器旋涡3min，再加入已经配好的3mmol/L水杨酸溶液定容至刻度，立刻放入预热好的37℃的恒温水中反应15min后，分别在510nm下的波长下，记录各自的吸光度值，将各值代入公式计算，分别平行做三次实验。按如下公式计算清除率[4]：
式中：A0—以蒸馏水代替待测液所得的吸光度;A1—样品液与H2O2反应后测得的吸光度;A2—水代替H2O2溶液测得的吸光度。
1.3.3.2 清除DPPH能力 DPPH自由基具有单电子，在可见光520nm处有很强的吸收光谱，其颜色是典型的紫色。在DPPH溶液中把银杏叶多糖清除剂加入，当其把里面的自由基清除掉以后，会使先前的溶液由紫色向黄色或无色变化，吸收值也会相应减小，银杏叶多糖清除剂能使单电子配对，在520nm用分光光度计进行测量定时，吸光度值也相应减少，溶液褪色。这种变化使其接受电子数量成定量关系，因此可以用这种方法测定。检测不同浓度的银杏叶多糖对DPPH的清除能力，以相同浓度VC溶液作阳性对照，计算DPPH的清除率[5-6]。 取1mL0.1mmoL/L的DPPH乙醇溶液于比色管中，分别加入2mL不同比例浓度的多糖样品液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL），摇匀，暗处静置30min后于520nm条件下测其吸光度。以VC做阳性对照组，计算DPPH的清除率。DPPH清除率的计算公式如下[7-8]：
式中：A0—蒸馏水与DPPH混合后的吸光度;A1—样品液与DPPH溶液混合后的吸光度;A2—样品液与蒸馏水混合后的吸光度。
2 结果与分析
2.1 银杏叶多糖的含量 如图1所示，求得线性回归方程即为葡萄糖的标准曲线，曲线方程为Y=1.3137X+0.2795，（R2=0.9824）。经检测银杏叶多糖的含量为5.52%。实验结果较李化强、吴菲菲等人测得的银杏叶粗多糖的结果稍大[3]，原因可能是利用水提醇沉法提取的银杏叶多糖中含有少量蛋白质、脂肪等物质。
2.2 银杏叶多糖的抗氧化性
2.2.1 对DPPH的清除作用 由图2可知银杏叶多糖溶液的浓度差影响着DPPH的清除能力。银杏叶多糖溶液浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL时，对DPPH的清除率分别为23.4%、28.2%、30.8%、42.7%、52.9%、58.6%。当银杏叶的多糖浓度大于1.5mg/mL时，对DPPH的清除率显著升高。说明当银杏叶多糖的浓度增大时，对DPPH的清除能力也增强。相同溶液浓度下，以VC溶液作为阳性对照，对DPPH的清除率为82.9%、87.4%、88.2%、90.8%、92.6%、95.4%。说明阳性对照VC对DPPH也具有较好的清除作用。
2.2.2 对·OH的清除作用 羟自由基系活性氧一种，是人体内目前所知活性强，寿命短的自由基。可使细胞膜被破坏，血清抗蛋白酶失去活性，損伤基因导致细胞变异的出现和蓄积，从而导致疾病的发生，严重者会对基因造成破坏，导致机体发生系统紊乱。加入自由基清除剂后其破坏明显降低，以Vc做阳性对照，研究制备的不同浓度的银杏叶多糖溶液对·OH的清除作用，结果如图3所示。
由图3可知，银杏叶多糖溶液在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL时，对·OH的清除率分别为17.7%、39.0%、48.8%、51.9%、61.3%、59.5%。当银杏叶多糖浓度在2.5mg/mL时，其清除率为61.3%，而当银杏叶多糖浓度在3.0mg/mL时，清除率却有所下降，为59.5%。原因可能是使用紫外分光光度计检测时造成了误差。阳性对照VC在浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL时，·OH的清除率分别为72.9%、77.8%、82.8%、87.4%、89.7%、95.3%。可以看出阳性对照VC具有很好的抗氧化性。
3 结论与讨论
利用水提醇沉的方法提取银杏叶中的多糖，研究不同浓度银杏叶多糖的抗氧化性。结果表明，银杏叶多糖浓度在0～3mg/mL内，当浓度增加时，对DPPH的清除能力在逐渐增大，·OH的清除率也在逐渐增高，表明银杏叶多糖具有良好的抗氧化活性，但银杏叶多糖对DPPH的清除率明显低于VC，这与许春雨的研究结果一致[5]。
参考文献
[1]杨电增，邹兰兰，钱志伟.马齿苋多糖双酶法提取工艺优化及其抗氧化性研究[J].保鲜与加工，2021，21（02）：88-93.
[2]陈群，刘天骄.银杏叶多糖的抗肿瘤和免疫调节作用[J].中药药理与临床，2003.19（5）：18-19.
[3]杨俊游.银杏叶多糖提取、纯化及其含量的测定[J]海南医学院学报，2013，19（6）：735-737.
[4]张瑾，王文婷，王国霞.银杏外种皮及银杏叶提取液对冬枣保鲜的影响研究[J].宁夏农林科技，2018，59（07）：55-57.
[5]芦莲，戴余军，李长春.银杏叶多糖提取工艺的研究[J].中国酿造，2012，31（10）：106-108.
[6]Om P. Sharma，Tej K. Bhat. DPPH antioxidant assay revisited[J]. Food Chemistry，2009，113（4）：1202–1205.
[7]邓加聪，曾锈华，陈婕，郭婷婷，王志辉，郑虹.牛肝菌多糖的提取及抗氧化性研究[J].中国酿造，2019，38（10）：158-161.
[8]冯书珍，卢宇凤，刘南英，徐畅，谢广燕，冯学珍.海藻多糖的单糖组成对体外抗氧化活性的影响[J].天然产物研究与开发，2019，31（01）：116-121+169.
（责编：王慧晴）