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摘要：通过在养殖罗非鱼的水体里添加不同浓度的枯草芽孢杆菌，分别测定罗非鱼酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、溶菌酶五种免疫酶活性指标及生长性能指标，探讨在养殖水体中添加枯草芽孢杆菌对罗非鱼的免疫酶活性及生长性能的影响，目的为评价枯草芽孢杆菌在罗非鱼养殖过程中使用效果的生物学指标，以及为了推广枯草芽孢杆菌在罗非鱼养殖过程中提高罗非鱼免疫功能提供理论依据。
关键词：枯草芽孢杆菌；罗非鱼；免疫酶活性；生长性能
1材料及方法
1.1试验动物
本试验以罗非鱼为试验对象，挑选体质健壮、体表无伤的罗非鱼，平均每条罗非鱼的重量为15 g左右。
1.2试验设计
本试验于河北农业大学渤海校区实验育苗室内进行，水族箱规格为100 cm×60 cm×50 cm，试验前将水族箱和实验所用器具用高锰酸钾浸泡消毒24 h。水体体积为100 cm×60 cm×35 cm，并充分曝气24 h后将鱼放入水族箱中。共16个水族箱，每个水族箱里放25尾鱼。待鱼适应环境以后开始投喂饲料并正式试验。
试验分为5个处理组，每个试验组设3个平行，分别添加浓度为102、103、104、105、106 cfu/mL的枯草芽孢杆菌，对照组不添加枯草芽孢杆菌。每个水族箱中饲养25尾罗非鱼。
1.3日常管理
每天投食两次，上午8：30、下午2：30各投喂一次，投喂量以多数鱼不摄食为准。试验期间不换水，每天上午清洗过滤棉。试验期间定时观察罗非鱼的生长及健康状况，定期往水体里添加菌粉以保持水体菌的浓度。
1.4试验处理
实验开始后，在实验饲养的第30 d采样，采样时取其血液，用肝素钠润洗注射器后抽取2～3 mL的血液，放置冰箱冷冻条件下12 h，然后在离心机里离心，3 500 r/min离心15 min，取上清液待测。
生长性能的测定为罗非鱼的特定生长率及成活率，特定生长率的计算公式为SGR=100×（lnW末-lnW初）/t（养殖天数），成活率的计算公式为成活率=成活的数量÷总数量×100%。
免疫指标的测定为酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、溶菌酶（LZM），均为南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定，具体操作按其说明书进行。采用SPSS19.0对数据进行统计分析，运用ANOVA单因素进行方差分析及Duncan’s多重比较对实验所得出的结果进行显著性检验，显著水平为P<0.05。
2试验结果
2.1水体添加枯草芽孢杆菌对罗非鱼血清中酸性磷酸酶（ACP）活性的影响
添加枯草芽孢杆菌的浓度为104cfu/mL的鱼血清的ACP活性显著高于其他组（P<0.05），且试验组显著高于对照组。
2.2水体添加枯草芽孢杆菌对罗非鱼血清中碱性磷酸酶（AKP）活性的影响
添加枯草芽孢杆菌的浓度为104cfu/mL的鱼血清的AKP活性显著高于其他组（P<0.05），且试验组显著高于对照组。
2.3水体添加枯草芽孢杆菌对罗非鱼血清中谷草转氨酶（AST）活性的影响
添加枯草芽孢杆菌的浓度为104cfu/mL的鱼血清AST活性显著高于其他组（P<0.05），且试验组显著高于对照组。
2.4水体添加枯草芽孢杆菌对罗非鱼血清中谷丙转氨酶（ALT）活性的影响
添加枯草芽孢杆菌的浓度为104cfu/mL和105cfu/mL添加组的鱼血清ALT活性显著高于其他组（P<0.05），且试验组显著高于对照组。
2.5水体添加枯草芽孢杆菌对罗非鱼血清中溶菌酶（LZM）活性的影响
添加枯草芽孢杆菌的浓度为104cfu/mL的鱼血清的LZM活性显著高于其他组（P<0.05），且试验组显著高于对照组。
2.6对罗非鱼生长性能的影响
添加枯草芽孢杆菌浓度分别为102cfu/mL、103cfu/mL、104cfu/mL、105cfu/mL、106cfu/mL及对照组的特定生长率分别为2.628、2.918、3877、3.510、3.587、2.197，成活率分别为88%、92%、96%、92%、80%、80%。添加组的特定生长率显著高于空白组，添加浓度为104cfu/mL的生长性能表现最好。
3结论
酸性磷酸酶（ACP）是动物体内重要的调控酶，它可以直接参与血细胞的包囊作用和吞噬作用，并能帮助杀死及吞噬病原体。
在整个实验过程中，104cfu/mL添加组中ACP的活性最高，且添加组明显高于对照组，因此ACP可以作为评价动物免疫功能的指标。
碱性磷酸酶（AKP）普遍存在于动植物体内，是重要的调控酶，可直接参与磷酸基团的转移与磷酸脂的代谢，可为ADP磷酸转化形成ATP提供更多的必需无机磷酸，也是动物体内重要的解毒体系，可作为评价罗非鱼免疫功能的指标。
实验过程中，104cfu/mL添加组中AKP的活性最高，且添加效果最为明显，因此AKP可以作为评价罗非鱼的免疫功能指标。
谷草转氨酶（AST）是一种重要的氨基转移酶，广泛存在于动物组织细胞中。当血清中AST的活性升高或组织内AST的活性降低时，即表明动物机体的肝脏、心脏等内脏器官发生损伤。AST 活性变化也是反映肝细胞受到损伤的主要敏感指标。
在本试验阶段，104cfu/mL添加组的罗非鱼血清中AST活性最高，显著高于其他组（P<005），且试验组显著高于对照组。
谷丙转氨酶（ALT）是催化谷氨酸与丙酮酸之间的转氨作用，在肝脏内的活力最大的一种酶。存在于很多器官中，对肝脏的蛋白质代谢起到枢纽的作用，摄入的糖类、脂肪及其他营养物质经由转氨基作用转变为所需蛋白质，而转氨基作用最重要的就是需要谷丙转氨酶的催化作用。
在本试验阶段，104cfu/mL和105cfu/mL添加组的鱼血清ALT活性显著高于其他组（P<005），这两个添加组无明显差异（P>0.05），试验组显著高于对照组（P<0.01）。
溶菌酶（LZM）是一种碱性蛋白酶，广泛存在于动物体内的某些淋巴组织和体液中。LZM活性的高低，可作为衡量水产动物免疫状态的重要指标之一，在一定程度上也能反映出动物机体的非特异性体液免疫的状态。当血清中LZM活性提高时，机体的免疫能力也会相应提高。
在本试验中，104cfu/mL添加组鱼血清的LZM活性最高，且试验组的溶菌酶活性显著高于对照组。
特定生长率是指生长率与生长天数的比，是衡量生长状况的一个常用指标，特定生长率越大，代表每天体重增长越快。成活率表示成活的数量占总量的百分比，成活率越高，反映枯草芽孢杆菌对鱼的生长性能的影响越高。本试验中，104cfu/mL添加组罗非鱼的特定生长率和成活率都是最高的，且试验组明显高于对照组。
在养殖水体中添加枯草芽孢杆菌对养殖罗非鱼的免疫酶活性及生长性能都能起到一定的作用，且明显高于空白对照组，其中添加浓度为104cfu/mL的所起到的作用最为明显。
关键词：枯草芽孢杆菌；罗非鱼；免疫酶活性；生长性能
1材料及方法
1.1试验动物
本试验以罗非鱼为试验对象，挑选体质健壮、体表无伤的罗非鱼，平均每条罗非鱼的重量为15 g左右。
1.2试验设计
本试验于河北农业大学渤海校区实验育苗室内进行，水族箱规格为100 cm×60 cm×50 cm，试验前将水族箱和实验所用器具用高锰酸钾浸泡消毒24 h。水体体积为100 cm×60 cm×35 cm，并充分曝气24 h后将鱼放入水族箱中。共16个水族箱，每个水族箱里放25尾鱼。待鱼适应环境以后开始投喂饲料并正式试验。
试验分为5个处理组，每个试验组设3个平行，分别添加浓度为102、103、104、105、106 cfu/mL的枯草芽孢杆菌，对照组不添加枯草芽孢杆菌。每个水族箱中饲养25尾罗非鱼。
1.3日常管理
每天投食两次，上午8：30、下午2：30各投喂一次，投喂量以多数鱼不摄食为准。试验期间不换水，每天上午清洗过滤棉。试验期间定时观察罗非鱼的生长及健康状况，定期往水体里添加菌粉以保持水体菌的浓度。
1.4试验处理
实验开始后，在实验饲养的第30 d采样，采样时取其血液，用肝素钠润洗注射器后抽取2～3 mL的血液，放置冰箱冷冻条件下12 h，然后在离心机里离心，3 500 r/min离心15 min，取上清液待测。
生长性能的测定为罗非鱼的特定生长率及成活率，特定生长率的计算公式为SGR=100×（lnW末-lnW初）/t（养殖天数），成活率的计算公式为成活率=成活的数量÷总数量×100%。
免疫指标的测定为酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、溶菌酶（LZM），均为南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定，具体操作按其说明书进行。采用SPSS19.0对数据进行统计分析，运用ANOVA单因素进行方差分析及Duncan’s多重比较对实验所得出的结果进行显著性检验，显著水平为P<0.05。
2试验结果
2.1水体添加枯草芽孢杆菌对罗非鱼血清中酸性磷酸酶（ACP）活性的影响
添加枯草芽孢杆菌的浓度为104cfu/mL的鱼血清的ACP活性显著高于其他组（P<0.05），且试验组显著高于对照组。
2.2水体添加枯草芽孢杆菌对罗非鱼血清中碱性磷酸酶（AKP）活性的影响
添加枯草芽孢杆菌的浓度为104cfu/mL的鱼血清的AKP活性显著高于其他组（P<0.05），且试验组显著高于对照组。
2.3水体添加枯草芽孢杆菌对罗非鱼血清中谷草转氨酶（AST）活性的影响
添加枯草芽孢杆菌的浓度为104cfu/mL的鱼血清AST活性显著高于其他组（P<0.05），且试验组显著高于对照组。
2.4水体添加枯草芽孢杆菌对罗非鱼血清中谷丙转氨酶（ALT）活性的影响
添加枯草芽孢杆菌的浓度为104cfu/mL和105cfu/mL添加组的鱼血清ALT活性显著高于其他组（P<0.05），且试验组显著高于对照组。
2.5水体添加枯草芽孢杆菌对罗非鱼血清中溶菌酶（LZM）活性的影响
添加枯草芽孢杆菌的浓度为104cfu/mL的鱼血清的LZM活性显著高于其他组（P<0.05），且试验组显著高于对照组。
2.6对罗非鱼生长性能的影响
添加枯草芽孢杆菌浓度分别为102cfu/mL、103cfu/mL、104cfu/mL、105cfu/mL、106cfu/mL及对照组的特定生长率分别为2.628、2.918、3877、3.510、3.587、2.197，成活率分别为88%、92%、96%、92%、80%、80%。添加组的特定生长率显著高于空白组，添加浓度为104cfu/mL的生长性能表现最好。
3结论
酸性磷酸酶（ACP）是动物体内重要的调控酶，它可以直接参与血细胞的包囊作用和吞噬作用，并能帮助杀死及吞噬病原体。
在整个实验过程中，104cfu/mL添加组中ACP的活性最高，且添加组明显高于对照组，因此ACP可以作为评价动物免疫功能的指标。
碱性磷酸酶（AKP）普遍存在于动植物体内，是重要的调控酶，可直接参与磷酸基团的转移与磷酸脂的代谢，可为ADP磷酸转化形成ATP提供更多的必需无机磷酸，也是动物体内重要的解毒体系，可作为评价罗非鱼免疫功能的指标。
实验过程中，104cfu/mL添加组中AKP的活性最高，且添加效果最为明显，因此AKP可以作为评价罗非鱼的免疫功能指标。
谷草转氨酶（AST）是一种重要的氨基转移酶，广泛存在于动物组织细胞中。当血清中AST的活性升高或组织内AST的活性降低时，即表明动物机体的肝脏、心脏等内脏器官发生损伤。AST 活性变化也是反映肝细胞受到损伤的主要敏感指标。
在本试验阶段，104cfu/mL添加组的罗非鱼血清中AST活性最高，显著高于其他组（P<005），且试验组显著高于对照组。
谷丙转氨酶（ALT）是催化谷氨酸与丙酮酸之间的转氨作用，在肝脏内的活力最大的一种酶。存在于很多器官中，对肝脏的蛋白质代谢起到枢纽的作用，摄入的糖类、脂肪及其他营养物质经由转氨基作用转变为所需蛋白质，而转氨基作用最重要的就是需要谷丙转氨酶的催化作用。
在本试验阶段，104cfu/mL和105cfu/mL添加组的鱼血清ALT活性显著高于其他组（P<005），这两个添加组无明显差异（P>0.05），试验组显著高于对照组（P<0.01）。
溶菌酶（LZM）是一种碱性蛋白酶，广泛存在于动物体内的某些淋巴组织和体液中。LZM活性的高低，可作为衡量水产动物免疫状态的重要指标之一，在一定程度上也能反映出动物机体的非特异性体液免疫的状态。当血清中LZM活性提高时，机体的免疫能力也会相应提高。
在本试验中，104cfu/mL添加组鱼血清的LZM活性最高，且试验组的溶菌酶活性显著高于对照组。
特定生长率是指生长率与生长天数的比，是衡量生长状况的一个常用指标，特定生长率越大，代表每天体重增长越快。成活率表示成活的数量占总量的百分比，成活率越高，反映枯草芽孢杆菌对鱼的生长性能的影响越高。本试验中，104cfu/mL添加组罗非鱼的特定生长率和成活率都是最高的，且试验组明显高于对照组。
在养殖水体中添加枯草芽孢杆菌对养殖罗非鱼的免疫酶活性及生长性能都能起到一定的作用，且明显高于空白对照组，其中添加浓度为104cfu/mL的所起到的作用最为明显。