【摘 要】
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目的 拯救嵌合人源免疫检查点细胞毒性T淋巴细胞(huCTLA4)抗体的重组流感病毒株,对其选择性杀伤肝癌细胞的效果进行全面鉴定并评价.方法 通过反向遗传学(reverse genetics,RG)技术,以A/PuertoRico/8/34(PR8)为载体,将编码人源CTLA4(huCTLA4)抗体重链和轻链的基因分别插入到PR8病毒的PB1和PA基因片段,构建重组质粒pFlu-huCTLA4-PB1、pFlu-huCTLA4-PA,与 PR8病毒的剩余6个骨架质粒 pHW191-PB2、pHW194-HA
【机 构】
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0750002张家口,河北北方学院研究生学院;100039北京,中国人民解放军总医院第五医学中心;475001,开封市传染病医院肝病科;100039北京,中国人民解放军总医院第五医学中心
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目的 拯救嵌合人源免疫检查点细胞毒性T淋巴细胞(huCTLA4)抗体的重组流感病毒株,对其选择性杀伤肝癌细胞的效果进行全面鉴定并评价.方法 通过反向遗传学(reverse genetics,RG)技术,以A/PuertoRico/8/34(PR8)为载体,将编码人源CTLA4(huCTLA4)抗体重链和轻链的基因分别插入到PR8病毒的PB1和PA基因片段,构建重组质粒pFlu-huCTLA4-PB1、pFlu-huCTLA4-PA,与 PR8病毒的剩余6个骨架质粒 pHW191-PB2、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M、pHW198-NS共转染COS Ⅰ和MDCK细胞,经病毒拯救、筛选、鉴定获得重组溶瘤病毒,命名为rFlu-huCTLA4.进一步通过血凝、TCID50测定重组流感病毒滴度;电镜观察病毒形态及大小分布;ELISA法测定huCTLA4抗体含量;结晶紫、MTS方法测定重组病毒对肝癌细胞的选择性杀伤效果;流式细胞术检测重组病毒诱导肝癌细胞死亡方式.利用人源肿瘤异种移植模型肝癌小鼠模型,评价rFlu-huCTLA4在动物体内抗肿瘤作用.结果 rFlu-huCTLA4第1代的血凝效价为27～28,且可在鸡胚中稳定传代;MTS、结晶紫结果显示,rFlu-huCTLA4可选择性杀伤肝癌细胞而对正常细胞无显著影响;重组病毒接种鸡胚可检测到高水平的huCTLA4抗体分泌;凋亡实验表明,rFlu-huCTLA4可能主要通过细胞凋亡的方式诱导肝癌细胞死亡进而靶向杀伤肝癌细胞.动物实验表明,rFlu-huCTLA4能显著减小小鼠肿瘤体积和质量,且动物肿瘤部位的病毒载量显著高于其他部位,肿瘤部位病理切片结果表明,rFlu-huCTLA4组可显著促进肿瘤细胞坏死.结论 嵌合huCTLA4抗体的重组流感病毒株rFlu-huCTLA4在体内外可选择性杀伤肝癌细胞,有望为溶瘤病毒靶向治疗肝癌提供新的临床策略.
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