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摘要：从海南地区土壤中分离得到1株苏云金芽孢杆菌（Bt）BJH705。经PCR鉴定结果显示，该菌中含有cry7Ab类基因，其晶体形态为双锥形；以全长引物对其进行扩增，得到大小为3 417 bp的片段；通过SDS-PAGE结果显示，此菌株Cry7Ab杀虫晶体蛋白分子量约为130 ku，编码1 139个氨基酸残基，等电点为4.83；序列已提交GenBank注册，登录号为KX010669；对Cry7Ab蛋白的跨膜区域进行分析，得到此蛋白由亲水域和疏水域形成跨膜区，其跨膜区大约由19个疏水氨基酸组成，经Cry7Ab蛋白保守结构域分析含有3个结构域。
关键词：苏云金芽孢杆菌；cry7Ab基因；克隆；表达；杀虫晶体蛋白
中图分类号： Q786文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）14-0085-03
在世界范围内广泛分布着一种革兰氏阳性菌——苏云金芽孢杆菌（Bt），其归类于芽孢杆菌科芽孢杆菌属[1]。它的母细胞会在形成芽孢的同时伴随着形成晶体蛋白，称之为伴胞晶体，伴胞晶体呈现立方体、球形、菱形、镶嵌形、无定形，是具有杀伤活力的杀虫晶体蛋白。
由cry7类基因编码的蛋白的分子量约为130 ku，晶体一般为双锥形。到目前为止，Crickmore（http：//www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/）上已经登录了cry7类21种基因，共37个，其中包含9个cry7Ab基因。但是关于cry7类基因的杀虫活性却很少被报道，有研究发现，cry7类基因可以编码对鞘翅目害虫有活性的蛋白；据相关的研究表明，Cry7Ab3蛋白对马铃薯甲虫有较高的杀虫活性[2]。Cry7Ab4蛋白胰蛋白酶（trypsin）酶解液对鞘翅目的大猿叶甲（Colophellus bowringi）显示出一定的杀虫活性，但对鳞翅目的小菜蛾（Plutella xylostella）、甜菜夜蛾（Spadoptera exigua）、亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）、马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）、榆蓝叶甲（Pyrrhalta aenescens）和直翅目的东亚飞蝗（Locusta migraloria manilensis）基本无杀虫活性[3]。Cry7Ab8蛋白对马铃薯瓢虫2龄幼虫具有较高毒力，但对黄粉虫没有杀虫活性，这可能是由于马铃薯瓢虫和黄粉虫的中肠所含的蛋白酶不同[4]。Cry7Ca1蛋白对飞蝗有杀虫活性[5]。由于鞘翅目害虫的危害日益严重，而长期以来我国采用农药的防治方法给环境带来了严重危害[6-9]，因此筛选和鉴定对鞘翅目害虫有活性的基因极为重要。
1材料与方法
1.1材料
液体LB培养基：0.5%酵母粉，1.0%胰蛋白胨，1.0% NaCl，pH值为7.0，121 ℃高温高压灭菌20 min。
固体LB培养基：0.5%酵母粉，1.0%胰蛋白胨，1.0% NaCl，1.3%琼脂，pH值为7.0，121 ℃高温高压灭菌20 min。
Taq DNA聚合酶、KOD酶、pMD19-T 载体、氨苄青霉素、X-Gal、IPTG、DNA marker、蛋白质分子量标准均购自TaKaRa公司；质粒DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒购自美国Axygen公司；引物由金维智生物工程（北京）有限公司合成；分析纯化学试剂均为市售。
1.2方法
1.2.1土样来源及Bt菌株的分离
土样采自中国海南地区，采用温度法[10]进行Bt菌株的筛选。
1.2.2Bt基因组的提取
分离纯化后的Bt菌株在固体LB培养基上30 ℃过夜培养12 h，采用张彦蕊等的方法[11]提取基因组。
1.2.3cry7Ab基因的鉴定与克隆
根据GenBank上公布的cry7类基因的序列，利用primer 5设计cry7基因的鉴定引物cry7-F/cry7-R及cry7Ab全长的引物cry7Ab-F/cry7Ab-R，序列见表1（金唯智合成）。
利用cry7-F/cry7-R引物对，用Taq DNA聚合酶进行cry7基因的鉴定，PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，52 ℃复性1 min，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃ 延伸10 min。利用cry7Ab-F/cry7Ab-R引物对，用KOD酶进行cry7Ab全长基因扩增，PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性 15 s，52 ℃复性30 s，68 ℃延伸 3.5 min，30个循环；68 ℃延伸10 min。将上述PCR产物均用0.7%琼脂糖进行电泳检测，利用ChampGel 6000全自动凝胶成像系统（gel documentation and image analysis system）成像。
按照Axygen公司的胶回收试剂盒说明书进行扩增产物的回收纯化。将回收的PCR产物分别连接pMD19-T克隆载体和pEB表达载体并转入大肠杆菌（Escherichia coli） JM109中，篩选阳性克隆进行PCR验证，以便确认是否连有目的片段。提取连接正确重组细菌的质粒送金维智生物工程（北京）有限公司进行序列测定。
1.2.4cry7Ab基因在大肠杆菌中的表达
提取上述阳性转化子重组质粒转入大肠杆菌BL21中，进行IPTG诱导表达。首先低温离心收集诱导物并弃上清，用20 mmol/L Tris HCl（pH值为8.0）缓冲液悬浮细胞并进行超声波破碎，取样用于 SDS-PAGE 分析。大肠杆菌质粒DNA提取、连接、转化方法参照王立光等的方法[12-14]，杀虫晶体蛋白样品制备和SDS-PAGE电泳检测方法参见束长龙等的方法[15-17]，并进行蛋白分析。
关键词：苏云金芽孢杆菌；cry7Ab基因；克隆；表达；杀虫晶体蛋白
中图分类号： Q786文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）14-0085-03
在世界范围内广泛分布着一种革兰氏阳性菌——苏云金芽孢杆菌（Bt），其归类于芽孢杆菌科芽孢杆菌属[1]。它的母细胞会在形成芽孢的同时伴随着形成晶体蛋白，称之为伴胞晶体，伴胞晶体呈现立方体、球形、菱形、镶嵌形、无定形，是具有杀伤活力的杀虫晶体蛋白。
由cry7类基因编码的蛋白的分子量约为130 ku，晶体一般为双锥形。到目前为止，Crickmore（http：//www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/）上已经登录了cry7类21种基因，共37个，其中包含9个cry7Ab基因。但是关于cry7类基因的杀虫活性却很少被报道，有研究发现，cry7类基因可以编码对鞘翅目害虫有活性的蛋白；据相关的研究表明，Cry7Ab3蛋白对马铃薯甲虫有较高的杀虫活性[2]。Cry7Ab4蛋白胰蛋白酶（trypsin）酶解液对鞘翅目的大猿叶甲（Colophellus bowringi）显示出一定的杀虫活性，但对鳞翅目的小菜蛾（Plutella xylostella）、甜菜夜蛾（Spadoptera exigua）、亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）、马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）、榆蓝叶甲（Pyrrhalta aenescens）和直翅目的东亚飞蝗（Locusta migraloria manilensis）基本无杀虫活性[3]。Cry7Ab8蛋白对马铃薯瓢虫2龄幼虫具有较高毒力，但对黄粉虫没有杀虫活性，这可能是由于马铃薯瓢虫和黄粉虫的中肠所含的蛋白酶不同[4]。Cry7Ca1蛋白对飞蝗有杀虫活性[5]。由于鞘翅目害虫的危害日益严重，而长期以来我国采用农药的防治方法给环境带来了严重危害[6-9]，因此筛选和鉴定对鞘翅目害虫有活性的基因极为重要。
1材料与方法
1.1材料
液体LB培养基：0.5%酵母粉，1.0%胰蛋白胨，1.0% NaCl，pH值为7.0，121 ℃高温高压灭菌20 min。
固体LB培养基：0.5%酵母粉，1.0%胰蛋白胨，1.0% NaCl，1.3%琼脂，pH值为7.0，121 ℃高温高压灭菌20 min。
Taq DNA聚合酶、KOD酶、pMD19-T 载体、氨苄青霉素、X-Gal、IPTG、DNA marker、蛋白质分子量标准均购自TaKaRa公司；质粒DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒购自美国Axygen公司；引物由金维智生物工程（北京）有限公司合成；分析纯化学试剂均为市售。
1.2方法
1.2.1土样来源及Bt菌株的分离
土样采自中国海南地区，采用温度法[10]进行Bt菌株的筛选。
1.2.2Bt基因组的提取
分离纯化后的Bt菌株在固体LB培养基上30 ℃过夜培养12 h，采用张彦蕊等的方法[11]提取基因组。
1.2.3cry7Ab基因的鉴定与克隆
根据GenBank上公布的cry7类基因的序列，利用primer 5设计cry7基因的鉴定引物cry7-F/cry7-R及cry7Ab全长的引物cry7Ab-F/cry7Ab-R，序列见表1（金唯智合成）。
利用cry7-F/cry7-R引物对，用Taq DNA聚合酶进行cry7基因的鉴定，PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，52 ℃复性1 min，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃ 延伸10 min。利用cry7Ab-F/cry7Ab-R引物对，用KOD酶进行cry7Ab全长基因扩增，PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性 15 s，52 ℃复性30 s，68 ℃延伸 3.5 min，30个循环；68 ℃延伸10 min。将上述PCR产物均用0.7%琼脂糖进行电泳检测，利用ChampGel 6000全自动凝胶成像系统（gel documentation and image analysis system）成像。
按照Axygen公司的胶回收试剂盒说明书进行扩增产物的回收纯化。将回收的PCR产物分别连接pMD19-T克隆载体和pEB表达载体并转入大肠杆菌（Escherichia coli） JM109中，篩选阳性克隆进行PCR验证，以便确认是否连有目的片段。提取连接正确重组细菌的质粒送金维智生物工程（北京）有限公司进行序列测定。
1.2.4cry7Ab基因在大肠杆菌中的表达
提取上述阳性转化子重组质粒转入大肠杆菌BL21中，进行IPTG诱导表达。首先低温离心收集诱导物并弃上清，用20 mmol/L Tris HCl（pH值为8.0）缓冲液悬浮细胞并进行超声波破碎，取样用于 SDS-PAGE 分析。大肠杆菌质粒DNA提取、连接、转化方法参照王立光等的方法[12-14]，杀虫晶体蛋白样品制备和SDS-PAGE电泳检测方法参见束长龙等的方法[15-17]，并进行蛋白分析。