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摘要[目的]建立冻鸡肉中金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法。[方法]根据金黄色葡萄球菌特异性耐热核酸酶基因序列设计2对引物，建立LAMP检测方法，并用于检测采购自贵阳市各大超市的冻鸡肉样品。[结果]设计合成的2对引物和建立的LAMP方法检测金黄色葡萄球菌具有良好的特異性，反应体系的灵敏度为65 CFU/mL。检测采购自贵阳市各大超市和经人为污染的264份冻鸡肉样品分别用LAMP方法检测，并用国标方法检测验证，其特异性为95.2%，准确度为97.3%。[结论]该研究建立的方法为实现在冻鸡肉中金黄色葡萄球菌的快速检测奠定了良好的基础。
关键词金黄色葡萄球菌；LAMP；检测方法；冻鸡肉
中图分类号S851.34+7文献标识码A文章编号0517-6611（2018）25-0162-02
Establishment of Rapid Detection Method of Staphylococcus aureus LAMP in Frozen Chicken
YUAN Guangyu， XIE Tibo，GONG Weiyao et al
（Guizhou Kwinbon Science and Technology for Food Safety Co.，Ltd.，Guiyang，Guizhou 550009）
Abstract[Objective] The research aimed to establish a LAMP method for detection of S. aureus in frozen chicken. [Method] Two pairs of primers were designed based on the nuc gene sequence of S. aureus. A LAMP detection method was established and used to detect frozen chicken samples from major supermarkets in Guiyang.[Result]Two pairs of primers and the established LAMP method had good specificity for the detection of S. aureus. The sensitivity was 65 CFU/mL. 264 frozen chicken samples purchased from major supermarkets in Guiyang and polluted by humans were detected by LAMP method and verified by national standard method. The specificity was 95.2% and the accuracy was 97.3%.[Conclusion]The method established in this study laid a good foundation for rapid detection of S. aureus in frozen chicken.
Key wordsStaphylococcus aureus；LAMP；Detection method；Frozen chicken
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）简称金葡菌，是一种革兰氏阳性需氧或兼性厌氧菌，广泛分布于人类生活环境中，多寄生在人和动物的表皮、呼吸道、消化道及化脓性伤口[1-2]。金葡菌无运动能力，不产生芽孢，最适生长环境为温度37 ℃、pH 7.4，能够适应10%的高盐环境[3]。金葡菌本身不具致病性，但其在繁殖过程合成肠毒素，从而导致食物中毒，出现恶心、呕吐、腹泻等症状[4-5]。食品在生产、加工过程中的不严格管控，极易受该菌污染。
在国内，由金葡菌导致的食物中毒事件时有发生[6-7]。同时，冻品被检测出金葡菌污染也时有报道[8]。目前，对金葡菌的主要检测方法有国标方法、PCR、免疫检测等[9-10]。各检测方法各有所长，国标方法准确检测率100%，但操作要求无菌，检测周期较长，无法实现快速出结果；免疫检测方法虽然时间较短，但受到灵敏度的制约[9]；PCR方法也需要精密仪器实现控制温度变化，并且灵敏度也较低[11]。
环介导等温扩增（LAMP）由Notomi等[12]于2000年开发的一种基于PCR的DNA恒温扩增方法，其具有特异性高、灵敏度高、检测速度快等特点，被应用在微生物、寄生虫的检测等领域[13-15]。笔者根据金葡菌的特异性nuc基因序列设计引物，实现在冻鸡肉中金葡菌的快速检测，以期为冻品中金葡菌的快速检测奠定基础。
1材料与方法
1.1材料与仪器
细菌基因组DNA提取试剂盒DP302购自天根生化科技（北京）有限公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；Isothermal Mix、荧光等温扩增仪GENEⅡ型购自OptiGene公司；试验菌株信息为金黄色葡萄球菌（CGMCC 1.282）、大肠杆菌（CICC 10003）、枯草芽孢杆菌（CGMCC 1.821）、单增李斯特菌（CMCC 54003）、伤害沙门氏菌（CMCC 50071），由北京勤邦生物技术有限公司提供；冻鸡肉购自贵阳市各大超市。
1.2研究方法
1.2.1引物设计。
根据在GenBank中查询到金黄色葡萄球菌耐热核酸酶（nuc）基因序列（GenBank DQ507382.1），分别设计2对引物，引物序列如表1所示。
1.2.2LAMP反应体系的建立。 試验菌株按试剂盒方法步骤提取DNA，并测定核酸浓度。以提取的DNA作为模板，建立20 μL反应体系。PCR管中依次加入等温扩增混合液10 μL、引物F3/B3（0.2 μmol/L）1 μL、引物FIP/BIP（0.8 μmol/L）1 μL、DNA模板（50 μg/L）1 μL、ddH2O 7 μL。将反应体系混合均匀，放入荧光等温扩增仪，65 ℃扩增45 min。
1.2.3LAMP检测方法的特异性和灵敏度。
为验证设计的引物序列经LAMP检测金葡菌nuc基因序列特异性，将菌株金黄色葡萄球菌（CGMCC 1.282）、大肠杆菌（CICC 10003）、枯草芽孢杆菌（CGMCC 1.821）、单增李斯特菌（CMCC 54003）、伤害沙门氏菌（CMCC 50071）按适宜培养条件液体培养过夜，按试剂盒方法提取细菌基因组DNA，测定DNA浓度，定量至50 μg/L。以细菌基因组DNA作为模板，用“1.2.2”建立的方法验证特异性。
将金葡菌按10倍梯度稀释至10-8，国标方法（GB 4789.10—2016）进行菌落计数，测定金葡菌菌活数。将各稀释菌液煮沸、离心，取1 μL作为模板，用于验证LAMP方法的灵敏度。
1.2.4冻鸡肉中金葡菌的检测。
将采购自各大超市的金葡菌阴性冻鸡肉，取50 g接种已知浓度的金葡菌进行污染，作为阳性样本，以不添加金葡菌株冻鸡肉作为阴性样本，共计264份。分别用国标方法（GB 4789.10—2016）和LAMP方法盲检。
2结果与分析
2.1LAMP检测的特异性
经荧光等温扩增仪扩增金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特菌、伤害沙门氏菌5株致病菌基因组DNA，结果如图1所示。结果显示，金黄色葡萄球菌荧光信号呈指数增加，其余4株均未检测到荧光信号的变化，表明设计的nuc基因序列用于LAMP检测金黄色葡萄球菌特异性高。
2.2LAMP检测的灵敏度
金葡菌经一系列稀释后，对各稀释度利用建立的LAMP检测荧光信号，结果如图2所示。结果显示，5个梯度（32、47、65、82、100 CFU/mL）中，随着时间增加32、47 CFU/mL荧光信号均未变化，65 CFU/mL在30 min左右开始检测到荧光信号增强，82、100 CFU/mL均在反应开始较短时间内荧光信号开始增强。因此，金葡菌灵敏度能够达65 CFU/mL，说明试验建立的LAMP方法具有较高的灵敏度。
2.3LAMP检测冻鸡肉
将采购自贵阳市各大超市冻鸡肉和人为污染冻鸡肉，根据建立的LAMP和国标方法检测金葡菌，结果显示，测出阳性样品分别为LAMP方法138份，国标方法145份；阴性样本分别为LAMP方法126份，国标方法119份。分析结果可知建立的LAMP检测特异性为95.2%，准确度为973%。
3讨论与结论
冻鸡肉因其长期存放在低温环境，并不适于微生物的生长需求，因此在受到微生物污染后，短时间内并不会出现明显的变质，但仍然存在微生物污染后的潜在危险。因此建立一种快速准确的检测方法相当重要。金葡菌是食品污染的主要菌之一，其检测方法中国标方法检测主要受时间的制约，每次检测约需48 h，耗时耗力[16]。PCR方法受灵敏度的限制，现有文献报道的其检测限多在103～105 CFU/mL[17-18]。而LAMP方法很好地避免了以上2种方法存在的问题，能够实现冻品更快速准确的检测需求。
该研究利用金葡菌nuc基因作为检测基因，建立一种LAMP技术快速检测冻鸡肉中金葡菌的方法。根据基因序列（GenBank DQ507382.1）设计的2对引物，建立的LAMP检测金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特菌、伤害沙门氏菌的基因组DNA，以验证设计的2对引物检测金葡菌特异性。为获取足量细菌基因组DNA，检测前对5株菌株分别进行扩增。扩增细菌经试剂盒方法提取，测定核酸蛋白浓度并统一稀释至50 μg/L用于LAMP检测。检测结果显示，5株菌株仅金葡菌荧光信号呈指数增强，表明nuc基因作为金葡菌检测具有特异性。金葡菌菌液经一系列稀释，菌液分别用于LAMP检测荧光信号强度、国标方法确定活菌数。检测结果显示，建立的LAMP方法灵敏度为65 CFU/mL。该研究建立的LAMP方法与国标方法分别盲检采购自贵阳市各大超市冻鸡肉及人为污染的冻鸡肉264份，由结果可知LAMP检测特异性为95.2%，准确度为973%，表明该研究建立的LAMP快速检测方法检测结果可靠，准确度、特异度高。
参考文献
[1] KHAN S，RASHEED F，ZAHRA R.Genetic polymorphism of agr locus and antibiotic resistance of Staphylococcus aureus at two hospitals in Pakistan[J].Pak J Med Sci，2014，30（1）：172-176.
[2] GITAU G K，BUNDI R M，VANLEEUWEN J，et al.Evaluation of PetrifilmsTM as a diagnostic test to detect bovine mastitis organisms in Kenya[J].Trop Anim Health Prod，2013，45（3）：883-886.
关键词金黄色葡萄球菌；LAMP；检测方法；冻鸡肉
中图分类号S851.34+7文献标识码A文章编号0517-6611（2018）25-0162-02
Establishment of Rapid Detection Method of Staphylococcus aureus LAMP in Frozen Chicken
YUAN Guangyu， XIE Tibo，GONG Weiyao et al
（Guizhou Kwinbon Science and Technology for Food Safety Co.，Ltd.，Guiyang，Guizhou 550009）
Abstract[Objective] The research aimed to establish a LAMP method for detection of S. aureus in frozen chicken. [Method] Two pairs of primers were designed based on the nuc gene sequence of S. aureus. A LAMP detection method was established and used to detect frozen chicken samples from major supermarkets in Guiyang.[Result]Two pairs of primers and the established LAMP method had good specificity for the detection of S. aureus. The sensitivity was 65 CFU/mL. 264 frozen chicken samples purchased from major supermarkets in Guiyang and polluted by humans were detected by LAMP method and verified by national standard method. The specificity was 95.2% and the accuracy was 97.3%.[Conclusion]The method established in this study laid a good foundation for rapid detection of S. aureus in frozen chicken.
Key wordsStaphylococcus aureus；LAMP；Detection method；Frozen chicken
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）简称金葡菌，是一种革兰氏阳性需氧或兼性厌氧菌，广泛分布于人类生活环境中，多寄生在人和动物的表皮、呼吸道、消化道及化脓性伤口[1-2]。金葡菌无运动能力，不产生芽孢，最适生长环境为温度37 ℃、pH 7.4，能够适应10%的高盐环境[3]。金葡菌本身不具致病性，但其在繁殖过程合成肠毒素，从而导致食物中毒，出现恶心、呕吐、腹泻等症状[4-5]。食品在生产、加工过程中的不严格管控，极易受该菌污染。
在国内，由金葡菌导致的食物中毒事件时有发生[6-7]。同时，冻品被检测出金葡菌污染也时有报道[8]。目前，对金葡菌的主要检测方法有国标方法、PCR、免疫检测等[9-10]。各检测方法各有所长，国标方法准确检测率100%，但操作要求无菌，检测周期较长，无法实现快速出结果；免疫检测方法虽然时间较短，但受到灵敏度的制约[9]；PCR方法也需要精密仪器实现控制温度变化，并且灵敏度也较低[11]。
环介导等温扩增（LAMP）由Notomi等[12]于2000年开发的一种基于PCR的DNA恒温扩增方法，其具有特异性高、灵敏度高、检测速度快等特点，被应用在微生物、寄生虫的检测等领域[13-15]。笔者根据金葡菌的特异性nuc基因序列设计引物，实现在冻鸡肉中金葡菌的快速检测，以期为冻品中金葡菌的快速检测奠定基础。
1材料与方法
1.1材料与仪器
细菌基因组DNA提取试剂盒DP302购自天根生化科技（北京）有限公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；Isothermal Mix、荧光等温扩增仪GENEⅡ型购自OptiGene公司；试验菌株信息为金黄色葡萄球菌（CGMCC 1.282）、大肠杆菌（CICC 10003）、枯草芽孢杆菌（CGMCC 1.821）、单增李斯特菌（CMCC 54003）、伤害沙门氏菌（CMCC 50071），由北京勤邦生物技术有限公司提供；冻鸡肉购自贵阳市各大超市。
1.2研究方法
1.2.1引物设计。
根据在GenBank中查询到金黄色葡萄球菌耐热核酸酶（nuc）基因序列（GenBank DQ507382.1），分别设计2对引物，引物序列如表1所示。
1.2.2LAMP反应体系的建立。 試验菌株按试剂盒方法步骤提取DNA，并测定核酸浓度。以提取的DNA作为模板，建立20 μL反应体系。PCR管中依次加入等温扩增混合液10 μL、引物F3/B3（0.2 μmol/L）1 μL、引物FIP/BIP（0.8 μmol/L）1 μL、DNA模板（50 μg/L）1 μL、ddH2O 7 μL。将反应体系混合均匀，放入荧光等温扩增仪，65 ℃扩增45 min。
1.2.3LAMP检测方法的特异性和灵敏度。
为验证设计的引物序列经LAMP检测金葡菌nuc基因序列特异性，将菌株金黄色葡萄球菌（CGMCC 1.282）、大肠杆菌（CICC 10003）、枯草芽孢杆菌（CGMCC 1.821）、单增李斯特菌（CMCC 54003）、伤害沙门氏菌（CMCC 50071）按适宜培养条件液体培养过夜，按试剂盒方法提取细菌基因组DNA，测定DNA浓度，定量至50 μg/L。以细菌基因组DNA作为模板，用“1.2.2”建立的方法验证特异性。
将金葡菌按10倍梯度稀释至10-8，国标方法（GB 4789.10—2016）进行菌落计数，测定金葡菌菌活数。将各稀释菌液煮沸、离心，取1 μL作为模板，用于验证LAMP方法的灵敏度。
1.2.4冻鸡肉中金葡菌的检测。
将采购自各大超市的金葡菌阴性冻鸡肉，取50 g接种已知浓度的金葡菌进行污染，作为阳性样本，以不添加金葡菌株冻鸡肉作为阴性样本，共计264份。分别用国标方法（GB 4789.10—2016）和LAMP方法盲检。
2结果与分析
2.1LAMP检测的特异性
经荧光等温扩增仪扩增金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特菌、伤害沙门氏菌5株致病菌基因组DNA，结果如图1所示。结果显示，金黄色葡萄球菌荧光信号呈指数增加，其余4株均未检测到荧光信号的变化，表明设计的nuc基因序列用于LAMP检测金黄色葡萄球菌特异性高。
2.2LAMP检测的灵敏度
金葡菌经一系列稀释后，对各稀释度利用建立的LAMP检测荧光信号，结果如图2所示。结果显示，5个梯度（32、47、65、82、100 CFU/mL）中，随着时间增加32、47 CFU/mL荧光信号均未变化，65 CFU/mL在30 min左右开始检测到荧光信号增强，82、100 CFU/mL均在反应开始较短时间内荧光信号开始增强。因此，金葡菌灵敏度能够达65 CFU/mL，说明试验建立的LAMP方法具有较高的灵敏度。
2.3LAMP检测冻鸡肉
将采购自贵阳市各大超市冻鸡肉和人为污染冻鸡肉，根据建立的LAMP和国标方法检测金葡菌，结果显示，测出阳性样品分别为LAMP方法138份，国标方法145份；阴性样本分别为LAMP方法126份，国标方法119份。分析结果可知建立的LAMP检测特异性为95.2%，准确度为973%。
3讨论与结论
冻鸡肉因其长期存放在低温环境，并不适于微生物的生长需求，因此在受到微生物污染后，短时间内并不会出现明显的变质，但仍然存在微生物污染后的潜在危险。因此建立一种快速准确的检测方法相当重要。金葡菌是食品污染的主要菌之一，其检测方法中国标方法检测主要受时间的制约，每次检测约需48 h，耗时耗力[16]。PCR方法受灵敏度的限制，现有文献报道的其检测限多在103～105 CFU/mL[17-18]。而LAMP方法很好地避免了以上2种方法存在的问题，能够实现冻品更快速准确的检测需求。
该研究利用金葡菌nuc基因作为检测基因，建立一种LAMP技术快速检测冻鸡肉中金葡菌的方法。根据基因序列（GenBank DQ507382.1）设计的2对引物，建立的LAMP检测金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特菌、伤害沙门氏菌的基因组DNA，以验证设计的2对引物检测金葡菌特异性。为获取足量细菌基因组DNA，检测前对5株菌株分别进行扩增。扩增细菌经试剂盒方法提取，测定核酸蛋白浓度并统一稀释至50 μg/L用于LAMP检测。检测结果显示，5株菌株仅金葡菌荧光信号呈指数增强，表明nuc基因作为金葡菌检测具有特异性。金葡菌菌液经一系列稀释，菌液分别用于LAMP检测荧光信号强度、国标方法确定活菌数。检测结果显示，建立的LAMP方法灵敏度为65 CFU/mL。该研究建立的LAMP方法与国标方法分别盲检采购自贵阳市各大超市冻鸡肉及人为污染的冻鸡肉264份，由结果可知LAMP检测特异性为95.2%，准确度为973%，表明该研究建立的LAMP快速检测方法检测结果可靠，准确度、特异度高。
参考文献
[1] KHAN S，RASHEED F，ZAHRA R.Genetic polymorphism of agr locus and antibiotic resistance of Staphylococcus aureus at two hospitals in Pakistan[J].Pak J Med Sci，2014，30（1）：172-176.
[2] GITAU G K，BUNDI R M，VANLEEUWEN J，et al.Evaluation of PetrifilmsTM as a diagnostic test to detect bovine mastitis organisms in Kenya[J].Trop Anim Health Prod，2013，45（3）：883-886.