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摘要 [目的]建立并验证双葛止泻口服液中绿原酸的含量测定方法。[方法]采用Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm× 4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液梯度洗脱;检测波长为327 nm;流速为1.0 mL/min;柱温为25 ℃。[结果]绿原酸进样量在0.082 5～0.825 0 μg与峰面积呈良好的线性关系（r = 0.999 9），平均回收率为104.0%，RSD为0.4%。[结论]该方法简便、准确、专属性强，可用于双葛止泻口服液中绿原酸的质量控制。
关键词 绿原酸;双葛止泻口服液;高效液相色谱法
中图分类号 R286文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）10-0167-03
Abstract [Objective] The method for determination of the content of chlorogenic acid in Shuangge antidiarrhea oral liquid was developed and validated. [Method] The analysis was performed on an Agilent ZORBAX SBC18 column（150 mm×4.6 mm， 5 μm）. The gradient mobile phase was consisted of acetonitrile -0.4% phosphoric acid solution， and the detection wavelength was 327 nm. The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was 25 ℃. [Result] The linear range of the calibration curves for chlorogenic acid was 0.082 5-0.825 0 μg （r = 0.999 9）， and the average recovery was 104.0% with RSD of 0.4%. [Conclusion] The method is simple and accurate with high specificity， which can be used to determine the content of chlorogenic acid in Shuangge Antidiarrhea oral liquid.
Key words Chlorogenic acid;Shuangge antidiarrhea oral liquid;HPLC
雙葛止泻口服液是由金银花、葛根、黄芩等6味中药采用现代提取工艺，经离心纯化，加入辅料，灭菌而制成的口服液制剂。临床试验结果表明，本方具有清热燥湿、解毒止泻的功效，可用于仔猪湿热泄泻。本方是在中医古籍《伤寒论》中经典方剂“葛根芩连汤”的基础上，通过组方加减、工艺优化、剂型改进而制成的中兽药制剂。金银花为本方的君药，性甘寒，具有清热解毒、疏散风热的功能。现代研究表明，金银花具有解热、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗凝血等药理作用，其中绿原酸是金银花中的主要功效成分[1-5]。
由于该制剂为中兽药复方新制剂，目前尚无质量标准，为了更好地控制该制剂的质量，笔者采用高效液相色谱梯度洗脱法，建立双葛止泻口服液中绿原酸的含量测定方法，并对该方法进行耐用性研究，以期为该制剂的质量控制提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器。Waters e2695型高效液相色谱仪，配2489型紫外检测器（美国Waters公司）;AB135-S型电子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）。
1.1.2 试药与试剂。绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号110753-201415，含量96.2%）、双葛止泻口服液（洛阳惠中兽药有限公司，批号20170201、20170202、20170203，规格：每1 mL相当于原生药0.45 g）;乙腈，HPLC级，Thermo Fisher Scientific公司;磷酸，HPLC级，天津市科密欧化学试剂有限公司;水为超纯水。
1.2 方法
1.2.1
色谱条件与系统适用性。色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm× 4.6 mm，5 μm）;梯度洗脱，流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（0～12 min，乙腈11%;12～13 min，乙腈由11%上升至40%;13～18 min，乙腈40%;18～19 min，乙腈由40%下降至11%;19～25 min，乙腈11%），流速1.0 mL/min;柱温25 ℃;检测波长327 nm;进样量10 μL。理论板数按绿原酸峰计算应不低于1 000。
1.2.2 对照品贮备液的制备。取绿原酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶解制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得（10 ℃以下保存）。
1.2.3 对照品溶液的制备。精密吸取对照品贮备液5 mL，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，即得（10 ℃以下保存）。
1.2.4 供试品溶液的制备。精密量取本品2 mL，置50 mL容量瓶中，加10%乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.2.5 阴性对照溶液的制备。按处方制备缺金银花的阴性对照样品，按“1.2.4”方法制成阴性对照溶液，即得。
1.2.6 方法学考察。
1.2.6.1 专属性考察。分别取“1.2.3”项下对照品溶液、“1.2.4”项下供试品溶液及“1.2.5”项下阴性对照溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按“1.2.1”色谱条件测定并记录色谱图。 1.2.6.2 线性关系考察。取“1.2.3”项下对照品溶液，分别精密吸取2、5、10、15、20 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标、绿原酸的进样量（X，μg）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。
1.2.6.3 精密度试验。取“1.2.3”项下对照品溶液，按“1.2.1”色谱条件，精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，连续进样6针，记录色谱图，测定峰面积并计算RSD。
1.2.6.4 重复性试验。取双葛止泻口服液（批号20170201），按照“1.2.4”方法制备供试品溶液，分别制备6份，测定峰面积并计算含量及RSD。
1.2.6.5 稳定性试验。取双葛止泻口服液（批号20170201），按照“1.2.4”方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12 h进样，测定峰面积并计算RSD。
1.2.6.6 加样回收率试验。取已知含量的双葛止泻口服液样品6份（批号20170201，绿原酸含量1.01 mg/mL），每份1 mL，置50 mL容量瓶中，各精密加入“1.2.2”项下对照品贮备液5 mL，按照“1.2.4”方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，测定峰面积并计算含量及加样回收率。
1.2.7 耐用性。
为了考察色谱条件发生小的变动时测定结果受影响的程度，分别考察流动相比例、柱温、流速及色谱柱型号发生变化时样品含量的变化情况。按“1.2.3”和“1.2.4”方法分别制备对照品溶液与供试品溶液，采用单因素法，每次变动其中一个因素，固定其他因素为中间条件，依法测定含量，并计算每个因素下含量测定结果的RSD。
1.2.8 样品测定。
取双葛止泻口服液样品（批号20170201、20170202、20170203），按“1.2.4”方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，依法测定并计算样品中绿原酸的含量。
2 结果与分析
2.1 方法学考察
2.1.1 专属性考察。按“1.2.6.1”方法进行操作，结果发现（图1），供试品溶液在与绿原酸对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，阴性对照在与绿原酸对照品色谱相应的位置处无色谱峰，说明该方法专属性较好。
2.1.2 线性关系考察。按“1.2.6.2”方法进行操作，绘制标准曲线并计算回归方程，结果得出绿原酸的回归方程为Y=3 128 437.351 7X-48 317.243 9（r=0.999 9），表明绿原酸进样量在0.082 5～0.825 0 μg峰面积与进样量线性关系良好。
2.1.3 精密度试验。按“1.2.6.3”方法进行操作，连续进样6针，记录色谱图，测得峰面积的RSD为0.2%，表明仪器精密度良好。
2.1.4 重复性试验。按“1.2.6.4”方法进行操作，分别制备6份供试品溶液，进样测定，结果得出6份样品含量的RSD为0.3%，表明该方法重复性良好。
2.1.5 稳定性试验。按“1.2.6.5”方法进行操作，分别在不同时间点进样分析并计算峰面积的RSD，结果得出RSD为0.3%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.1.6 加样回收率试验。按“1.2.6.6”方法进行操作，结果发现（表1），6份样品的加样回收率为103.28%～104.36%，平均回收率为104.0%，RSD为0.4%，表明该方法准确度良好。
2.2 耐用性
按照“1.2.7”方法进行操作，结果表明（表2），当流动相比例、柱温、流速发生微小变化以及使用不同型号的色谱柱时，对含量测定结果无显著影响，表明色谱条件的耐用性良好。
2.3 样品测定
按照“1.2.8”方法操作，分别对双葛止泻口服液3批样品（20170201、20170202、20170203）的含量进行测定，结果发现这3批样品的含量分别为0.99、0.85、0.99 mg/mL。
3 讨论与结论
3.1 檢测波长的选择
通过紫外扫描，绿原酸在328 nm处有最大吸收，因《中国兽药典》2015年版一部[6]金银花药材含量测定项绿原酸检测波长为327 nm，且文献报道中[7-9]，绿原酸的检测波长也多采用327 nm。综合考虑，选择327 nm为检测波长。
3.2 色谱条件的考察
参考《中国兽药典》2015年版一部金银花药材及相关文献方法[10]，流动相以乙腈- 0.4%磷酸溶液（13∶87）为基础进行比例调整，结果以乙腈- 0.4%磷酸溶液（11∶89）为流动相梯度洗脱，所得色谱峰峰形较好，阴性对照无干扰。通过不同流动相比例、柱温、流速、pH、色谱柱的耐用性试验，表明该方法色谱条件的耐用性较好。
3.3 流动相洗脱方式的选择
为缩短样品运行时间，提高检测效率，分别比较了等度洗脱与梯度洗脱2种条件下的色谱行为。等度洗脱的流动相为乙腈-0.4%磷酸水（11∶89），梯度洗脱条件同“1.2.1 ”梯度洗脱程序，结果发现，在等度洗脱条件下，采用色谱柱Aglient ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），样品中最后一个峰保留时间为46.488 min。在梯度洗脱条件下，样品运行时间为25 min，流动相的比例变化发生在主峰之后，可以将主峰之后的成分尽快冲出而缩短运行时间，且对主峰的色谱行为没有影响。因此确定绿原酸的含量测定采用梯度洗脱。
该研究建立了一种高效液相色谱法测定双葛止泻口服液中绿原酸含量的方法，该方法简便、准确、专属性好，可用于该制剂中绿原酸的质量控制。
参考文献
[1] 朱静，丰杰，贾毓宁.金银花中绿原酸含量不确定度的评定[J].中成药，2017，39（10）：2207-2209.
[2] 夏伟，余永亮，杨红旗，等.金银花化学成分及药理作用研究进展[J].安徽农业科学，2017，45（33）：126-127，165.
[3] 宋亚玲，王红梅，倪付勇.金银花中酚酸类成分及其抗炎活性研究[J].中草药，2015，46（4）：490-495.
[4] 路俊仙，梁瑞雪，林慧彬.金银花抗流感病毒作用研究进展[J].现代中药研究与实践，2018，32（5）：77-81.
[5] 吴娇，王聪，于海川.金银花中的化学成分及其药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2019，25（4）：225-234.
[6] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典：一部[S].北京：中国农业出版社，2015.
[7] 赵增成，林树乾，李桂明，等.清营口服液质量检测方法的研究[J].中国畜牧兽医，2016，43（6）：1647-1653.
[8] 刘中均，朱力阳，冯光富，等.HPLC测定紫蒲痛风合剂中的绿原酸[J].华西药学杂志，2016，31（6）：638-639.
[9] 刘亭，李梅，胡贺佳，等.白茄根中绿原酸的含量测定[J].安徽农业科学，2018，46（25）：164-167，175.
[10] 雍燕，方炳虎，刘国昌，等.HPLC法同时测定金叶清瘟散中绿原酸和咖啡酸的含量[J].中国兽药杂志，2014，48（9）：30-33.
关键词 绿原酸;双葛止泻口服液;高效液相色谱法
中图分类号 R286文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）10-0167-03
Abstract [Objective] The method for determination of the content of chlorogenic acid in Shuangge antidiarrhea oral liquid was developed and validated. [Method] The analysis was performed on an Agilent ZORBAX SBC18 column（150 mm×4.6 mm， 5 μm）. The gradient mobile phase was consisted of acetonitrile -0.4% phosphoric acid solution， and the detection wavelength was 327 nm. The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was 25 ℃. [Result] The linear range of the calibration curves for chlorogenic acid was 0.082 5-0.825 0 μg （r = 0.999 9）， and the average recovery was 104.0% with RSD of 0.4%. [Conclusion] The method is simple and accurate with high specificity， which can be used to determine the content of chlorogenic acid in Shuangge Antidiarrhea oral liquid.
Key words Chlorogenic acid;Shuangge antidiarrhea oral liquid;HPLC
雙葛止泻口服液是由金银花、葛根、黄芩等6味中药采用现代提取工艺，经离心纯化，加入辅料，灭菌而制成的口服液制剂。临床试验结果表明，本方具有清热燥湿、解毒止泻的功效，可用于仔猪湿热泄泻。本方是在中医古籍《伤寒论》中经典方剂“葛根芩连汤”的基础上，通过组方加减、工艺优化、剂型改进而制成的中兽药制剂。金银花为本方的君药，性甘寒，具有清热解毒、疏散风热的功能。现代研究表明，金银花具有解热、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗凝血等药理作用，其中绿原酸是金银花中的主要功效成分[1-5]。
由于该制剂为中兽药复方新制剂，目前尚无质量标准，为了更好地控制该制剂的质量，笔者采用高效液相色谱梯度洗脱法，建立双葛止泻口服液中绿原酸的含量测定方法，并对该方法进行耐用性研究，以期为该制剂的质量控制提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器。Waters e2695型高效液相色谱仪，配2489型紫外检测器（美国Waters公司）;AB135-S型电子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）。
1.1.2 试药与试剂。绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号110753-201415，含量96.2%）、双葛止泻口服液（洛阳惠中兽药有限公司，批号20170201、20170202、20170203，规格：每1 mL相当于原生药0.45 g）;乙腈，HPLC级，Thermo Fisher Scientific公司;磷酸，HPLC级，天津市科密欧化学试剂有限公司;水为超纯水。
1.2 方法
1.2.1
色谱条件与系统适用性。色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm× 4.6 mm，5 μm）;梯度洗脱，流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（0～12 min，乙腈11%;12～13 min，乙腈由11%上升至40%;13～18 min，乙腈40%;18～19 min，乙腈由40%下降至11%;19～25 min，乙腈11%），流速1.0 mL/min;柱温25 ℃;检测波长327 nm;进样量10 μL。理论板数按绿原酸峰计算应不低于1 000。
1.2.2 对照品贮备液的制备。取绿原酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶解制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得（10 ℃以下保存）。
1.2.3 对照品溶液的制备。精密吸取对照品贮备液5 mL，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，即得（10 ℃以下保存）。
1.2.4 供试品溶液的制备。精密量取本品2 mL，置50 mL容量瓶中，加10%乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.2.5 阴性对照溶液的制备。按处方制备缺金银花的阴性对照样品，按“1.2.4”方法制成阴性对照溶液，即得。
1.2.6 方法学考察。
1.2.6.1 专属性考察。分别取“1.2.3”项下对照品溶液、“1.2.4”项下供试品溶液及“1.2.5”项下阴性对照溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按“1.2.1”色谱条件测定并记录色谱图。 1.2.6.2 线性关系考察。取“1.2.3”项下对照品溶液，分别精密吸取2、5、10、15、20 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标、绿原酸的进样量（X，μg）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。
1.2.6.3 精密度试验。取“1.2.3”项下对照品溶液，按“1.2.1”色谱条件，精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，连续进样6针，记录色谱图，测定峰面积并计算RSD。
1.2.6.4 重复性试验。取双葛止泻口服液（批号20170201），按照“1.2.4”方法制备供试品溶液，分别制备6份，测定峰面积并计算含量及RSD。
1.2.6.5 稳定性试验。取双葛止泻口服液（批号20170201），按照“1.2.4”方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12 h进样，测定峰面积并计算RSD。
1.2.6.6 加样回收率试验。取已知含量的双葛止泻口服液样品6份（批号20170201，绿原酸含量1.01 mg/mL），每份1 mL，置50 mL容量瓶中，各精密加入“1.2.2”项下对照品贮备液5 mL，按照“1.2.4”方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，测定峰面积并计算含量及加样回收率。
1.2.7 耐用性。
为了考察色谱条件发生小的变动时测定结果受影响的程度，分别考察流动相比例、柱温、流速及色谱柱型号发生变化时样品含量的变化情况。按“1.2.3”和“1.2.4”方法分别制备对照品溶液与供试品溶液，采用单因素法，每次变动其中一个因素，固定其他因素为中间条件，依法测定含量，并计算每个因素下含量测定结果的RSD。
1.2.8 样品测定。
取双葛止泻口服液样品（批号20170201、20170202、20170203），按“1.2.4”方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，依法测定并计算样品中绿原酸的含量。
2 结果与分析
2.1 方法学考察
2.1.1 专属性考察。按“1.2.6.1”方法进行操作，结果发现（图1），供试品溶液在与绿原酸对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，阴性对照在与绿原酸对照品色谱相应的位置处无色谱峰，说明该方法专属性较好。
2.1.2 线性关系考察。按“1.2.6.2”方法进行操作，绘制标准曲线并计算回归方程，结果得出绿原酸的回归方程为Y=3 128 437.351 7X-48 317.243 9（r=0.999 9），表明绿原酸进样量在0.082 5～0.825 0 μg峰面积与进样量线性关系良好。
2.1.3 精密度试验。按“1.2.6.3”方法进行操作，连续进样6针，记录色谱图，测得峰面积的RSD为0.2%，表明仪器精密度良好。
2.1.4 重复性试验。按“1.2.6.4”方法进行操作，分别制备6份供试品溶液，进样测定，结果得出6份样品含量的RSD为0.3%，表明该方法重复性良好。
2.1.5 稳定性试验。按“1.2.6.5”方法进行操作，分别在不同时间点进样分析并计算峰面积的RSD，结果得出RSD为0.3%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.1.6 加样回收率试验。按“1.2.6.6”方法进行操作，结果发现（表1），6份样品的加样回收率为103.28%～104.36%，平均回收率为104.0%，RSD为0.4%，表明该方法准确度良好。
2.2 耐用性
按照“1.2.7”方法进行操作，结果表明（表2），当流动相比例、柱温、流速发生微小变化以及使用不同型号的色谱柱时，对含量测定结果无显著影响，表明色谱条件的耐用性良好。
2.3 样品测定
按照“1.2.8”方法操作，分别对双葛止泻口服液3批样品（20170201、20170202、20170203）的含量进行测定，结果发现这3批样品的含量分别为0.99、0.85、0.99 mg/mL。
3 讨论与结论
3.1 檢测波长的选择
通过紫外扫描，绿原酸在328 nm处有最大吸收，因《中国兽药典》2015年版一部[6]金银花药材含量测定项绿原酸检测波长为327 nm，且文献报道中[7-9]，绿原酸的检测波长也多采用327 nm。综合考虑，选择327 nm为检测波长。
3.2 色谱条件的考察
参考《中国兽药典》2015年版一部金银花药材及相关文献方法[10]，流动相以乙腈- 0.4%磷酸溶液（13∶87）为基础进行比例调整，结果以乙腈- 0.4%磷酸溶液（11∶89）为流动相梯度洗脱，所得色谱峰峰形较好，阴性对照无干扰。通过不同流动相比例、柱温、流速、pH、色谱柱的耐用性试验，表明该方法色谱条件的耐用性较好。
3.3 流动相洗脱方式的选择
为缩短样品运行时间，提高检测效率，分别比较了等度洗脱与梯度洗脱2种条件下的色谱行为。等度洗脱的流动相为乙腈-0.4%磷酸水（11∶89），梯度洗脱条件同“1.2.1 ”梯度洗脱程序，结果发现，在等度洗脱条件下，采用色谱柱Aglient ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），样品中最后一个峰保留时间为46.488 min。在梯度洗脱条件下，样品运行时间为25 min，流动相的比例变化发生在主峰之后，可以将主峰之后的成分尽快冲出而缩短运行时间，且对主峰的色谱行为没有影响。因此确定绿原酸的含量测定采用梯度洗脱。
该研究建立了一种高效液相色谱法测定双葛止泻口服液中绿原酸含量的方法，该方法简便、准确、专属性好，可用于该制剂中绿原酸的质量控制。
参考文献
[1] 朱静，丰杰，贾毓宁.金银花中绿原酸含量不确定度的评定[J].中成药，2017，39（10）：2207-2209.
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[3] 宋亚玲，王红梅，倪付勇.金银花中酚酸类成分及其抗炎活性研究[J].中草药，2015，46（4）：490-495.
[4] 路俊仙，梁瑞雪，林慧彬.金银花抗流感病毒作用研究进展[J].现代中药研究与实践，2018，32（5）：77-81.
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[10] 雍燕，方炳虎，刘国昌，等.HPLC法同时测定金叶清瘟散中绿原酸和咖啡酸的含量[J].中国兽药杂志，2014，48（9）：30-33.