探讨高浓度草酸作用于人肾小管上皮细胞HK-2后核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)炎症小体在草酸钙肾结石形成过程中的激活作用机制。
方法通过测定细胞培养基中乳酸脱氢酶(LDH)的含量、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色法分析草酸对HK-2细胞的毒性及损伤；使用相差显微镜观察高浓度草酸作用于HK-2细胞后细胞表面晶体黏附；通过Western blot法和实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)分别检测高浓度草酸作用于HK-2细胞后NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)及白细胞介素-1β(IL-1β)蛋白和mRNA表达量的影响，同时检测高浓度草酸作用于HK-2细胞后对透明质酸合酶1(HAS1)、透明质酸合酶2(HAS2)、透明质酸合酶3(HAS3)、骨桥蛋白(OPN)以及CD44 mRNA表达的影响，并采用二氯荧光黄二乙酸酯(DCFH-DA)检测活性氧自由基(ROS)；Western blot和FQ-PCR法分别检测使用ROS抑制剂N-乙酰基半胱氨酸(NAC)预处理HK-2细胞后高浓度草酸作用于细胞后NLRP3的蛋白及mRNA的表达水平变化；使用RNA干扰技术，将NLRP3-小干扰RNA(siRNA)和阴性对照(NC)转染HK-2细胞后，相差显微镜观察晶体黏附变化，FQ-PCR法分别检测HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CD44 mRNA表达水平变化。
结果使用不同浓度的草酸处理HK-2细胞24 h，测定LDH含量结果显示当草酸浓度为0.8 mmol/L时，细胞培养基中LDH开始比草酸浓度为0.6 mmol/L时显著增加[(528.37±25.65)比(300.55±17.18) mmol/L，P＝0.001]，DAPI染色法显示不同浓度草酸侧细胞数量分别为：55.67±3.30、52.33±6.13、52.33±2.05、58.00±9.09、50.00±1.63、47.33±2.05、33.67±3.30、20.33±2.05，当草酸浓度为1.0 mmol/L时，细胞数量开始比草酸浓度为0.8 mmol/L时明显减少(33.67±4.04比47.33±2.52，P＝0.008)；相差显微镜观察高浓度草酸＋一水草酸钙(COM)作用于HK-2细胞后晶体黏附数量明显多于对照组[(7.34±0.82)%比(5.29±0.73)%，P＝0.001]；高浓度草酸作用于HK-2细胞后24 h，通过Western blot和FQ-PCR发现，NLRP3、Caspase-1及IL-1β蛋白水平(1.82±0.04比1.00±0.02，P＝0.000；1.62±0.23比1.00±0.06，P＝0.021；1.37±0.16比1.00±0.18，P＝0.029)和mRNA表达(1.29±0.24比0.84±0.11，P＝0.011；2.16±0.29比1.04±0.14，P＝0.009；1.80±0.02比1.00±0.15，P＝0.002)均分别高于对照组，且HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CD44 mRNA(1.35±0.25比0.81±0.11，P＝0.049；2.46±0.29比0.84±0.14，P＝0.002；0.90±0.02比0.60±0.15，P＝0.039；1.68±0.27比1.00±0.22，P＝0.049；2.03±0.47比1.00±0.15，P＝0.040)表达水平亦均高于对照组；采用DCFH-DA检测ROS，发现草酸可引起细胞内发生氧化应激产生ROS(736.67±80.21比208.67±35.73，P＝0.001)，并且ROS抑制剂NAC作用后NLRP3的蛋白表达水平明显降低(1.53±0.31比4.50±0.40，P＝0.001)，而空白组与NAC组分别为0.90±0.10比1.00±0.26(P＝0.288)；与NC组比较，NLRP3-siRNA组细胞表面晶体黏附数量显著减少[(1.87±0.21)%比(3.57±0.12)%，P＝0.003]，且细胞内HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CD44 mRNA(1.06±0.07比2.44±0.47，P＝0.015；0.87±0.07比1.48±0.22，P＝0.021；1.24±0.16比1.72±0.10，P＝0.026；1.03±0.15比1.45±0.09，P＝0.026；0.63±0.07比1.31±0.12，P＝0.002)表达水平也明显下降。
结论高浓度草酸通过HK-2细胞内ROS的产生激活NLRP3炎症小体，进而通过改变细胞表面黏附性来促进草酸钙肾结石的形成。