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背景:血管内皮细胞生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)在血管内皮细胞生长因子的信号转导中有主导效应,并在某些疾病包括白血病的病理性血管生成中起关键作用。另外,白血病细胞分泌的血管内皮细胞生长因子还诱导自身表达VEGFR2,从而维持自身存活、增殖。目的:观察表达VEGFR2短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的慢病毒载体Lenti6/shVEGFR2在全身性NOD/SCID白血病模型鼠中的作用。设计:随机、平行对照、开放性实验。单位:中山大学附属第二医院儿科,中山大学生物工程研究中心。材料:实验于2004-05/2006-01在中山大学附属第二医院医学研究中心、中山大学生物工程研究中心完成。分别以HL60,EA·hy926细胞株作为实验用白血病细胞、人血管内皮细胞的来源。Block-iT Lentiviral RNAi Expression System(Invitrogen);human VEGFR2 Mcb(PE标记,R&D)。CD31组化试剂盒(武汉博士德公司),CD33-PE流式细胞荧光标记抗体(BD公司)。方法:①制备并筛选VEGFR2基因的最有效siRNA,并据此设计shRNA寡核苷酸链。②构建pU6/shVEGFR2入门克隆。瞬时转染细胞,构建表达克隆Lenti6/shVEGFR2,与ViraPowerTM Packaging Mix共转染到293FTTM细胞中,产生携带表达克隆的慢病毒载体。③pU6/shVEGFR2入门克隆转染和Lenti6/shVEGFR2转导HL60细胞,MTT法测定HL60细胞抑制率。④建立HL60白血病模型后观察注入人血管内皮细胞后小鼠骨髓微血管的分布。⑤将NOD/SCID小鼠20只随机分为4组,每组5只:白血病模型鼠组,白血病模型鼠静脉注射重组慢病毒组,白血病模型鼠静脉注射重组慢病毒和内皮细胞组及白血病模型鼠静脉注射内皮细胞组。检测各组小鼠的骨髓细胞CD33表达变化、骨髓微血管密度变化及外周血细胞涂片、肝、脾的肿瘤浸润情况,以了解Lenti6/shVEGFR2重组慢病毒对小鼠白血病的作用。主要观察指标:①VEGFR2siRNA鉴定结果。②pU6/shVEGFR2入门克隆转染HL60后对其VEGFR2表达的影响。③pU6/shVEGFR2入门克隆转染、Lenti6/shVEGFR2表达克隆转导HL60细胞后细胞抑制率比较。④慢病毒介导的shRNA对HL60模型鼠VEGF/VEGFR2旁分泌和自分泌的影响。结果:①pU6/shVEGFR2入门克隆转染HL60后对其VEGFR2表达的影响:VEGFR2siRNAc抑制HL60细胞效率最高,利用其构建的pU6/shVEGFR2入门克隆并转染HL60,抑制细胞效率达84.9%;显著抑制HL60细胞VEGFR2基因mRNA和蛋白的表达。②pU6/shVEGFR2入门克隆转染、Lenti6/shVEGFR2表达克隆转导HL60细胞后细胞抑制率比较:pU6/shVEGFR2入门克隆转染、Lenti6/shVEGFR2表达克隆转导HL60细胞后48h细胞抑制率相近,48h后入门克隆转染组细胞抑制率明显下降(P<0.01);而表达克隆转导组细胞抑制率变化缓慢,在96h达高峰,120h稍降,变化无显著差异。③慢病毒介导的shRNA对HL60模型鼠VEGF/VEGFR2旁分泌和自分泌的影响:白血病模型组、白血病模型鼠静脉注射重组慢病毒组、白血病模型鼠静脉注射重组慢病毒和内皮细胞组小鼠骨髓流式细胞仪HL60检测结果分别为(25.8%±4.9)%,(14.3%±5.1)%,(8.4±2.6)%,三组比较,差异有显著性意义(P<0.05);白血病模型鼠静脉注射重组慢病毒和内皮细胞组微血管密度明显小于白血病模型鼠静脉注射内皮细胞组。白血病模型鼠静脉注射重组慢病毒和内皮细胞组与其他组相比HL60细胞数最低。结论:①pLenti6/shVEGFR2表达克隆转导HL60细胞后持续高水平抑制细胞。重组慢病毒Lenti6/shVEGFR2具有抑制白血病小鼠骨髓血管生成的作用。②VEGFR2 siRNA可阻断白血病HL60细胞VEGF/VEGFR2自分泌的内环路,在体外、动物体内均得到验证。③VEGF/VEGFR2自分泌链和旁分泌链的联合阻断加强了抗白血病效果。