【摘 要】
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为探究产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)特异性K99-SIgA免疫复合物对激发小鼠黏膜免疫反应的影响,本实验构建pET-32a-K99/BL21(DE3)原核表达载体,经IPTG诱导表达后以亲和层析方法纯
【机 构】
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黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江 大庆 163319;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江 大庆 163319
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为探究产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)特异性K99-SIgA免疫复合物对激发小鼠黏膜免疫反应的影响,本实验构建pET-32a-K99/BL21(DE3)原核表达载体,经IPTG诱导表达后以亲和层析方法纯化制备了重组K99蛋白(rK99);采用rK99蛋白和ETEC标准菌株K99经腹腔注射免疫BALB/c小鼠制备鼠源K99多克隆抗体;采用PBS溶解的ETEC K99菌液口服感染BALB/c小鼠,获得含有特异性SIgA抗体的粪便上清,以His pull-down制备得到特异性K99-SIgA复合物;利用特异性K99-SIgA复合物刺激ETEC K99口服感染小鼠后分离的脾淋巴细胞,分别采用ELISPOT检测细胞因子、CCK-8法检测小鼠脾T淋巴细胞增殖以及小鼠T淋巴细胞CTLL-2活力.结果显示:rK99在E.coli BL21(DE3)中高效表达,纯化蛋白浓度约4.5 mg/mL;腹腔免疫后的小鼠血清检出较高效价的K99多克隆抗体,腹腔免疫后的小鼠血清检出较高的K99多抗效价;以ETEC K99菌液口服感染小鼠获得大量的特异性SIgA抗体,抗体水平在感染后42 d达到高峰;制备获得特异性K99-SIgA复合物,浓度约为2 mg/mL,K99多抗能够有效地与特异性K99-SIgA复合物反应;特异性K99-SIgA复合物刺激小鼠脾淋巴细胞相比K99单独抗原能更有效地上调TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-5细胞因子分泌水平,促进小鼠脾T淋巴细胞及小鼠效应T细胞CTLL-2的增殖活化,表明特异性K99-SIgA免疫复合物能够有效地增强小鼠的黏膜免疫应答.本研究为免疫复合物口服疫苗的研制提供了参考依据.
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