【摘 要】
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目的:探索高GC含量DNA的PCR扩增条件,为扩增达托霉素生物合成基因簇及拼接奠定基础。方法:在PCR扩增体系中,使用高保真的聚合酶及添加不同浓度的DMSO、7-deaza-dGTP等增强剂,
【机 构】
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军事医学科学院生物工程研究所,吉林大学生命科学学院,安徽大学生命科学学院
【基金项目】
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国家高技术研究发展计划子课题(2012AA022001-03D)
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目的:探索高GC含量DNA的PCR扩增条件,为扩增达托霉素生物合成基因簇及拼接奠定基础。方法:在PCR扩增体系中,使用高保真的聚合酶及添加不同浓度的DMSO、7-deaza-dGTP等增强剂,并选择合适的PCR循环程序,优化富含GC的DNA的PCR扩增条件。结果:向反应体系中额外添加1%~4%的DMSO可以显著提高富含GC的DNA的PCR扩增产物量,但会降低其特异性;7-deaza-dGTP可以提高扩增产物的特异性及保真度,但产量会有所下降。应用touch down PCR并在体系中添加7-deaza-dGTP能够提高扩增产物的特异性和产率,增加扩增的保真度。结论:应用优化的PCR扩增条件将所有达托霉素生物合成基因簇分段扩增出来,并可扩增出长达6 kb的片段,且序列完全正确,可以进行后续拼接。
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