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摘 要：本项目主要针对粪链球菌活菌制剂不耐受强胃酸以及常温下保存期短等问题，开展了粪链球菌微囊化技术的研究。用特定的壁材使粪链球菌微囊化，经人体模拟胃装置，微囊中的菌体保持较高的活性，且能在微囊中增殖。微囊化技术有希望应用于益生菌微生态制剂的科学发展。
关键词：益生菌；粪链球菌；微囊
粪链球菌是一种对畜禽有益的微生物，在饲料添加剂中普遍使用。将粪链球菌制剂直接饲喂畜禽后，有利于改善畜禽胃肠道内的微生物结构，竞争性排斥胃肠道内病原性微生物，维持其微生态平衡，增强消化功能，促进畜禽的营养吸收与健康发育，提高机体免疫能力。
一般来说，微生态制剂要求的最低活菌浓度为106～107CFU/mL。但是在液体状态下难以长期保存。另外，一般饲料的制粒温度、压力都会对乳酸菌的活性造成较大损失。再之，由于胃酸的杀菌作用，微生态制剂的活菌数在此过程中也会大幅度下降。
就目前而言，微囊化技术是保护菌体数量和活性最为有效和实用的方法。因此，微囊化有望提高粪链球菌菌在生产、贮存和消费过程中的稳定性，生产出耐贮存、耐高温、高压、耐酸性的粪链球菌微生态制剂。
本项目主要针对粪链球菌活菌制剂不耐受强胃酸以及常温下保存期短等问题，开展了粪链球菌微囊化技术的研究。
1 材料与方法
1.1 菌种
粪链球菌 河南牧业经济学院微生物实验室保存。
1.2 培养基
蛋白胨10g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，水1000mL。灭菌前pH调至6.7。115℃灭菌20min。
1.3 试验方法
1.3.1 芯材制备
被微囊化的核心物质称为芯材、其制备步骤如下：将经活化的粪链球菌以2.5%的接种量接种于100mL液体培养基中，37℃培养12h，然后4000rpm离心30min。收集沉淀菌泥即为芯材。
1.3.2 壁材制备
用作“包埋”的外层膜质，即壁材。选用壁材应考虑其可食性，可食性胶囊化材料应具有以下特性：a）能形成稳定的乳化液；b）能形成膜；c）无味无臭，对人、菌无毒；d）遇水易释放芯材。根据上述原则，本实验使用了海藻酸钠、壳聚糖等材料，其制作过程为：将1.5%的海藻酸钠与10%的菌泥混合于10mL的注射器中，通过4号针头，将海藻酸钠注射入1.5%CaCl2溶液中，形成海藻酸钙微球，去掉上清液，分别用0.1%CHES、1.0%CaCl2溶液洗涤，再与0.1%壳聚糖溶液反应，充分混合，形成的微囊再次以0.1%CHES、1.0%CaCl2溶液、生理盐水洗涤。之后，自然干燥。
1.3.3 人体胃模拟装置
本装置采用1000mL的恒温夹层容器，其中装有800mL淀粉基质溶液，此溶液配比为：可溶性淀粉100g，胃蛋白酶3000单位，用醋酸调pH5.0，再加水至800mL。同时配有吊篮，搅拌器，pH计等。吊篮中放入受试微囊，注意放置时要避开中心位置，搅拌速度控制在600r/min左右，在小烧杯中装入l.0 nmol/L盐酸，调节注入速度为0.1 ml/min。基质初始pH为5.0，进行模拟实验时加入盐酸至pH为1.0，持续搅拌。
1.3.4 活菌数的测定
利用活菌计数法，分别测定微囊化前活菌数目、微囊中活菌数目以及微囊经过胃环境处理后的活菌数目等。
2 结果与讨论
2.1 微囊化前后活菌数量的变化
分别测定微囊化前后活菌数量，结果见表1
从表1可以看出，包囊前活菌数量为109数量级水平，包囊后微球中的活菌数量有所下降，但是仍可以维持在108数量级水平，表明该方法对粪链球菌的活性影响极小，是一种温和的处理方法。
2.2 所制备微囊在胃环境处理前后活菌数量的变化
分别测定经过胃环境处理后，未进行微囊化处理的活菌数目和经过微囊化处理的活菌数目，结果见表2。
将未进行包囊的菌体放置于模拟胃中处理4h后，再测定菌体的活菌数量时，发现根本无法测出活菌的存在，而将粪链球菌体进行微囊化后再经模拟胃处理，菌体仍能达到5.8×107CFU/mL个，说明微囊化确实使菌体得到了有效的保护。而未经微囊化的菌体在经模拟胃处理4h后，菌体基本死亡。
2.3 微囊化对菌体生产的影响
将所制备的微囊化粪链球菌和未進行微囊化的粪链球菌，分别置于模拟胃中处理4h，再置于液体培养基中培养，定期测定pH变化情况及12h后还原糖的含量，结果见表3、表4。
未经微囊化的粪链球菌在经模拟胃处理4h后，菌体基本死亡，也不具有繁殖力，pH保持不变，还原糖含量也不下降，但采用微囊化方法制备的粪链球菌制剂，其pH值发酵过程中pH值呈下降趋势，且产酸较快。在培养12h后，pH降至5.5左右，还原糖含量降为1.2 左右。由此可见，该微囊化方法能较好的保护粪链球菌的活性。
2.4 微囊化粪链球菌的保藏性及稳定性
采用壳聚糖――海藻酸钠为囊材所制得的微囊，在常温下干燥，保存于密封的试剂瓶中，定期测定活菌数量，结果见表5。
由表5知，随着保存时间的延长，微囊中粪链球菌活菌含量变化不大，保存90天后经胃液处理4h，活菌含量仍可维持在107数量级水平，菌体繁殖能力变化也不大，将保存了90天的微囊化粪链球菌置于培养基中再次培养，测得活菌数目均可达到108数量级水平，说明用该方法制得的微囊化粪链球菌的保存性能良好。
3 结论
菌体由上述实验可知，粪链球菌活经过壳聚糖-海藻酸钠等材料微囊化后，菌体获得了极强的保护作用，可以有效地解决原菌体不耐受强胃酸，且常温下保存期短的实际问题。
参考文献
[1] 依可尔等.白僵菌微囊化技术的研究[J].微生物学通报，1992，19（3）：180.
[2] 何明清等.8701、8801活菌制剂对猪、禽和鱼的抗病及增产实验报告[J].中国微生态杂志，1989，（1）：34-37.
[3] 王柿荣.益生素研究进展[J].中国微生态学杂志，1990，2（2）：83.
4] 逊兵.国产微生物添加剂的研究与开发[J].中国饲料，1992，（8）：17.
作者简介：
刘树虎（1989年），男，山东莒南人，汉族，新疆大学生命科学与技术学院生物学专业在读研究生，人类遗传学研究方向。
关键词：益生菌；粪链球菌；微囊
粪链球菌是一种对畜禽有益的微生物，在饲料添加剂中普遍使用。将粪链球菌制剂直接饲喂畜禽后，有利于改善畜禽胃肠道内的微生物结构，竞争性排斥胃肠道内病原性微生物，维持其微生态平衡，增强消化功能，促进畜禽的营养吸收与健康发育，提高机体免疫能力。
一般来说，微生态制剂要求的最低活菌浓度为106～107CFU/mL。但是在液体状态下难以长期保存。另外，一般饲料的制粒温度、压力都会对乳酸菌的活性造成较大损失。再之，由于胃酸的杀菌作用，微生态制剂的活菌数在此过程中也会大幅度下降。
就目前而言，微囊化技术是保护菌体数量和活性最为有效和实用的方法。因此，微囊化有望提高粪链球菌菌在生产、贮存和消费过程中的稳定性，生产出耐贮存、耐高温、高压、耐酸性的粪链球菌微生态制剂。
本项目主要针对粪链球菌活菌制剂不耐受强胃酸以及常温下保存期短等问题，开展了粪链球菌微囊化技术的研究。
1 材料与方法
1.1 菌种
粪链球菌 河南牧业经济学院微生物实验室保存。
1.2 培养基
蛋白胨10g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，水1000mL。灭菌前pH调至6.7。115℃灭菌20min。
1.3 试验方法
1.3.1 芯材制备
被微囊化的核心物质称为芯材、其制备步骤如下：将经活化的粪链球菌以2.5%的接种量接种于100mL液体培养基中，37℃培养12h，然后4000rpm离心30min。收集沉淀菌泥即为芯材。
1.3.2 壁材制备
用作“包埋”的外层膜质，即壁材。选用壁材应考虑其可食性，可食性胶囊化材料应具有以下特性：a）能形成稳定的乳化液；b）能形成膜；c）无味无臭，对人、菌无毒；d）遇水易释放芯材。根据上述原则，本实验使用了海藻酸钠、壳聚糖等材料，其制作过程为：将1.5%的海藻酸钠与10%的菌泥混合于10mL的注射器中，通过4号针头，将海藻酸钠注射入1.5%CaCl2溶液中，形成海藻酸钙微球，去掉上清液，分别用0.1%CHES、1.0%CaCl2溶液洗涤，再与0.1%壳聚糖溶液反应，充分混合，形成的微囊再次以0.1%CHES、1.0%CaCl2溶液、生理盐水洗涤。之后，自然干燥。
1.3.3 人体胃模拟装置
本装置采用1000mL的恒温夹层容器，其中装有800mL淀粉基质溶液，此溶液配比为：可溶性淀粉100g，胃蛋白酶3000单位，用醋酸调pH5.0，再加水至800mL。同时配有吊篮，搅拌器，pH计等。吊篮中放入受试微囊，注意放置时要避开中心位置，搅拌速度控制在600r/min左右，在小烧杯中装入l.0 nmol/L盐酸，调节注入速度为0.1 ml/min。基质初始pH为5.0，进行模拟实验时加入盐酸至pH为1.0，持续搅拌。
1.3.4 活菌数的测定
利用活菌计数法，分别测定微囊化前活菌数目、微囊中活菌数目以及微囊经过胃环境处理后的活菌数目等。
2 结果与讨论
2.1 微囊化前后活菌数量的变化
分别测定微囊化前后活菌数量，结果见表1
从表1可以看出，包囊前活菌数量为109数量级水平，包囊后微球中的活菌数量有所下降，但是仍可以维持在108数量级水平，表明该方法对粪链球菌的活性影响极小，是一种温和的处理方法。
2.2 所制备微囊在胃环境处理前后活菌数量的变化
分别测定经过胃环境处理后，未进行微囊化处理的活菌数目和经过微囊化处理的活菌数目，结果见表2。
将未进行包囊的菌体放置于模拟胃中处理4h后，再测定菌体的活菌数量时，发现根本无法测出活菌的存在，而将粪链球菌体进行微囊化后再经模拟胃处理，菌体仍能达到5.8×107CFU/mL个，说明微囊化确实使菌体得到了有效的保护。而未经微囊化的菌体在经模拟胃处理4h后，菌体基本死亡。
2.3 微囊化对菌体生产的影响
将所制备的微囊化粪链球菌和未進行微囊化的粪链球菌，分别置于模拟胃中处理4h，再置于液体培养基中培养，定期测定pH变化情况及12h后还原糖的含量，结果见表3、表4。
未经微囊化的粪链球菌在经模拟胃处理4h后，菌体基本死亡，也不具有繁殖力，pH保持不变，还原糖含量也不下降，但采用微囊化方法制备的粪链球菌制剂，其pH值发酵过程中pH值呈下降趋势，且产酸较快。在培养12h后，pH降至5.5左右，还原糖含量降为1.2 左右。由此可见，该微囊化方法能较好的保护粪链球菌的活性。
2.4 微囊化粪链球菌的保藏性及稳定性
采用壳聚糖――海藻酸钠为囊材所制得的微囊，在常温下干燥，保存于密封的试剂瓶中，定期测定活菌数量，结果见表5。
由表5知，随着保存时间的延长，微囊中粪链球菌活菌含量变化不大，保存90天后经胃液处理4h，活菌含量仍可维持在107数量级水平，菌体繁殖能力变化也不大，将保存了90天的微囊化粪链球菌置于培养基中再次培养，测得活菌数目均可达到108数量级水平，说明用该方法制得的微囊化粪链球菌的保存性能良好。
3 结论
菌体由上述实验可知，粪链球菌活经过壳聚糖-海藻酸钠等材料微囊化后，菌体获得了极强的保护作用，可以有效地解决原菌体不耐受强胃酸，且常温下保存期短的实际问题。
参考文献
[1] 依可尔等.白僵菌微囊化技术的研究[J].微生物学通报，1992，19（3）：180.
[2] 何明清等.8701、8801活菌制剂对猪、禽和鱼的抗病及增产实验报告[J].中国微生态杂志，1989，（1）：34-37.
[3] 王柿荣.益生素研究进展[J].中国微生态学杂志，1990，2（2）：83.
4] 逊兵.国产微生物添加剂的研究与开发[J].中国饲料，1992，（8）：17.
作者简介：
刘树虎（1989年），男，山东莒南人，汉族，新疆大学生命科学与技术学院生物学专业在读研究生，人类遗传学研究方向。