【摘 要】
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目的 :降低HEV中和性单抗 (mAb) 13D8的鼠源性 ,表达其单链抗体 (scFv)。方法 :从分泌 13D8鼠mAb的杂交瘤细胞中 ,通过RT PCR克隆mAb的VL、VH 基因 ,并进一步组装成VH linker
【机 构】
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厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,
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目的 :降低HEV中和性单抗 (mAb) 13D8的鼠源性 ,表达其单链抗体 (scFv)。方法 :从分泌 13D8鼠mAb的杂交瘤细胞中 ,通过RT PCR克隆mAb的VL、VH 基因 ,并进一步组装成VH linker VL 型的scFv片段。将scFv片段克隆到pTO T7载体中 ,在大肠杆菌中进行表达。用ELISA、Westernblot检测scFv的活性。结果 :SDS PAGE表明 ,13D8的scFv在E .coli中得到高效表达 ,表达量达菌体总蛋白的 2 6 .8%左右 ,表达产物主要以包涵体的形式存在。间接ELISA和Westernblot检测表明 ,表达的 13D8的scFv能与HEVOFR2区中一段重组蛋白(NE2 )特异结合。竞争ELISA表明 ,scFv与原鼠mAb识别的为同一表位。结论 :成功地表达出具有免疫学活性的 13D8的scFv。
OBJECTIVE: To reduce the murine origin of HEV neutralizing monoclonal antibody (mAb) 13D8 and express its single chain antibody (scFv). Methods: The VL and VH genes of mAb were cloned by RT PCR from hybridoma cells secreting 13D8 murine mAb and further assembled into scFv fragment of VH linker VL. The scFv fragment was cloned into pTO T7 vector and expressed in E. coli. The activity of scFv was detected by ELISA and Western blot. Results: SDS-PAGE showed that the 13F8 scFv was highly expressed in E.coli, and the expression level was about 26.8% of the total bacterial protein. The expressed product mainly existed in the form of inclusion body. Indirect ELISA and Western blot showed that the expressed 13D8 scFv specifically bound to a segment of recombinant protein (NE2) in the HEVOFR2 region. Competition ELISA showed that the scFv recognized the same epitope as the murine mAb. Conclusion: The 13D8 scFv with immunological activity was successfully expressed.
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