【摘 要】
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为得出在大肠杆菌（E.coli）中制备PCV2 VLPs的最佳策略，通过PCR方法，从临床样本中扩增出野生型nCap基因，并对其进行密码子优化合成yCap。以pET-32a为表达载体，构建重组质粒pET-32a-nCap和pET-32a-yCap,以BL21和含有稀有密码子tRNA的Rosetta-gamiB感受态细胞作为表达菌株，以相同体系培养并经IPTG诱导表达，称重比较收获的湿菌体量，通过S
【基金项目】
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河北省重点研发计划资助项目（19226622D）； 河北省农业产业技术体系生猪创新团队资助项目（HBCT2018110207）；
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为得出在大肠杆菌（E.coli）中制备PCV2 VLPs的最佳策略，通过PCR方法，从临床样本中扩增出野生型nCap基因，并对其进行密码子优化合成yCap。以pET-32a为表达载体，构建重组质粒pET-32a-nCap和pET-32a-yCap,以BL21和含有稀有密码子tRNA的Rosetta-gamiB感受态细胞作为表达菌株，以相同体系培养并经IPTG诱导表达，称重比较收获的湿菌体量，通过SDS-PAGE与Western blot对Cap蛋白的表达方式及免疫反应性进行鉴定，使用镍亲和层析法进行纯化并通过SDS-PAGE分析纯化效率，并利用透射电镜观察能否形成VLP,将形成VLP的蛋白以弗氏佐剂为佐剂制备疫苗免疫小鼠，使用ELISA试剂盒测定特异性抗体IgG及细胞因子。结果显示，未经密码子优化的Cap蛋白只能在Rosetta-gamiB中表达，命名为VLP-B,经密码子优化的Cap蛋白在BL21和Rosetta-gamiB中均能表达，分别命名为VLP-A及VLP-C,3种蛋白均主要以可溶性形式表达且VLP-A的产量高于VLP-B、VLP-C;经镍亲和层析法纯化后皆可在透射电镜下观察到大量直径在20 nm左右的VLPs,但VLP-C纯化效率极低，VLP-A效果最佳，VLP-B次之；50μg/只重组VLPs免疫小鼠后（dpi）抗体水平迅速升高，14 d时均已达到阳性临界值，并维持在一个较高的水平直至42 d,同时也诱导产生了细胞因子反应，VLP-C免疫原性最佳，VLP-B次之，VLP-A相对较差。由此可知，将Cap基因密码子优化并提供大肠杆菌所缺少的稀有密码子的tRNA的促进VLPs组装效果要优于提供tRNA,更优于密码子优化，但蛋白表达量低，无法使用镍亲和层析得到理想效果，仍需进一步探索纯化方式。此外，仅将Cap基因密码子优化，产量相对较高，可经镍亲和层析法纯化，但免疫原性相对较弱。结果表明，本研究为PCV2 VLPs疫苗的进一步研究和生产提供了参考依据，对于降低疫苗成本和研制相关生物制品具有重大意义。
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