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摘要：辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV），目前在我国仅有在海南黄灯笼辣椒上严重危害的报道。利用湖南省和福建省采集的辣椒样本，检测辣椒ChiVMV的检出率，并克隆ChiVMV的CP基因序列，用邻近法构建了系统进化树，分析其遗传进化情况。结果表明，辣椒的ChiVMV省检出率湖南省为25%，福建省为20%；克隆了湖南省和福建省ChiVMV CP基因各1个，系统发育表明，湖南省和福建的ChiVMV株系与源于韩国ChiVMV株系聚在一个亚簇，而与我国其他地区ChiVMV亲缘关系较远，表明侵染辣椒的ChiVMV在我国进一步扩展，且存在遗传分化趋势。
关键词：辣椒脉斑驳病毒；检测；CP基因；系统发育分析
中图分类号： S436.418.1 9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0184-02
辣椒，一种茄科辣椒属植物，原产于中南美洲热带地区，在全世界都有广泛栽培，是世界上消费量最大的蔬菜之一。我国辣椒种植面积高达140万hm2以上，占据我国所有蔬菜作物种植面积的10%[1]。辣椒病毒病是威胁辣椒安全生产的重要病害，目前能够侵染辣椒的病毒有40多种[2-3]，其中辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）是危害辣椒作物的最主要病毒之一；该病毒于1979年首次在马来半岛的辣椒作物上被发现[4]，随后在世界上许多国家的辣椒作物上陆续被报道[5-7]。ChiVMV主要依靠蚜虫进行非持久性传播[4]，还能通过病株汁液和机械接触等方式传播，不能通过种子传播，因此，其传播扩散速度非常快。
在我国，ChiVMV首先在海南省被报道，严重危害海南的黄灯笼椒[8]，随后在陕西、云南等地区相继发生[8-10]。然而，到目前为止，尚未见ChiVMV在湖南以及福建等地区的报道。鉴于ChiVMV对辣椒生产的威胁，本研究检测了湖南和福建等地辣椒上ChiVMV的发生情况，克隆了湖南和福建等地ChiVMV株系的CP基因，并分析了其系统发育关系，以期为明确我国ChiVMV的分布及遗传进化提供科学依据。
1材料与方法
1.1供试材料
辣椒样品：2013年8月，在湖南省和福建省进行辣椒病毒病调查，发现部分地块辣椒病毒病的发病症状与ChiVMV类似，表现为植株矮小，叶片畸形（包括叶片黄化、叶卷曲、叶面枯斑、叶沿皱缩等）。采集湖南省辣椒样本16个、福建省辣椒样本8个。
ChiVMV ELISA检测试剂盒购自美国RB公司；cDNA试剂盒、DNTP、氨苄青霉素、EASY Taq DNA聚合酶和DNA回收试剂盒均购自北京全氏金生物技术有限公司，Trizol试剂盒购自Ambion公司，Elisa试剂盒购自RP公司；供试引物由华大基因公司合成，DNA测序测定由生物工程（上海）有限公司完成。
1.2ELISA检测
ELISA检测具体操作步骤按说明书进行。阳性对照为试剂盒自带ChiVMV病毒初提纯物；阴性对照为温室内健康辣椒苗的研磨液。
1.3RT-PCR
Trizol法抽提辣椒叶片总RNA，取500 ng总RNA，采用 All-in-one First-Strand cDNA合成试剂盒合成cDNA。以合成 cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，34个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增引物ChiVMV CP特异性引物，CPF（5′-GCGGGAGAGAGTGTTGATGCTG-3′），CPR（5′-TCGCCACTATTGAACAGCTTAAC-3′）；1.0%琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物，回收符合预期大小的条带，送生工生物工程（上海）有限公司测序。
1.4序列进化分析
从Genbank数据库中下载了9个ChiVMV典型分离物的CP基因序列。利用CLUSTAL W对所有CP序列进行多序列联配，利用Mega 5.0采用邻接法，构建ChiVMV CP 基因的系统发育树[11]。
2结果与分析
2.1ChiVMV ELISA检测
ELISA检测结果表明，从湖南采集的16个辣椒样本中，共有4个样本呈现阳性；而从福建采集的8个样本中，检测出2个阳性样本。
2.2ChiVMV CP基因克隆与序列分析
RT-PCR结果表明，扩增得到大小为1 100 bp的条带（含ChiVMV CP全基因序列以及部分上游基因序列），与预期大小一致。将RT-PCR扩增得到的条带进行序列测定，截取ChiVMV CP基因序列，输入NCBI进行比对，比对结果表明，福建和湖南等地的ChiVMV株系CP基因与来源于韩国辣椒的ChiVMV序列同源性最高（>97%）。
2.3序列的系统发育分析
从ChiVMV-hn和ChiVMV-fj的系统发育树（图1）可以看出，发育树共分成3个分支，分别为韩国株系分支、印度株系分支和中国株系分支，具有很强的地域性；而ChiVMV-hn和ChiVMV-fj与韩国的2个分离物（AJ972878.1和AM909717.1）构成1个分支，表明湖南和福建等地的ChiVMV株系与韩国ChiVMV的亲缘关系较近。系统发育分析还表明，我国辣椒上的ChiVMV具有遗传分化的趋势。
3结论
ChiVMV是一种（ ）ssRNA病毒，是Potyvirus Y病毒属的确定种，该病毒的存在严重制约着韩国、印度、泰国等国和我国台湾等地的辣椒生产，是造成这些地方辣椒减产的最主要原因之一[4，12]。本研究采用ELISA以及RT-PCR方法在湖南省和福建省等地的辣椒病样检测到ChiVMV，表明ChiVMV在我国的侵染范围正逐步扩展，对我国辣椒的生产具有潜在的威胁。 ChiVMV湖南和福建等地的CP基因序列的系统发育分析显示，我国的ChiVMV存在遗传分化的趋势；由于ChiVMV不同株系对辣椒的致病性存在差异，因此，我国ChiVMV的株系分化情况，急需开展进一步的研究，为分析ChiVMV对辣椒的危害提供科学依据，同时为该病毒的科学防控提供科学参考。
参考文献：
[1]孙国胜，马志虎，孙春青，等. 早春辣椒连作免耕栽培技术[J]. 中国蔬菜，2015，28（1）：55-56.
[2]Watterson J C. Development and breeding of resistance to pepper and tomato viruses[M]//Kyle M M. Resistance to viral diseases of vegetables：genetics and breeding. New York：Timber，1993：80-101.
[3]Green S K，Kim J S.Characteristics and control of viruses infecting peppers：a literature review[R]. Taiwan：Asian Vegetable Research and Development Center，1991.
[4]Ong C A，Varghese G，Ting W P. Aetiological investigations on a veinal mottle virus of chill（Capsicum annuum L.）newly recorded from peninsula Malaysia[J]. Mardi Res Bull，1979，7：78-88.
[5]Chiemsombat P，Sac-Ung N，Attathom S，et a1.Molecular taxonomy of a new potyvirus isolated from chilli pepper in Thailand[J]. Archive of Virology，1998，143（10）：1855-1863.
[6]Nono-Womdim R，Swai I S，Chadha M L，et a1.Occurrence of Chilli veinal mottle virus in Solanum aethiopicum in Tanzania[J]. Plant Disease，2001，85（7）：801-801.
[7]Anindya R，Joseph J，Gowri T D S，et a1.Complete genomic sequence of pepper vein banding virus（PVBV）：a distinct member of the genus Potyvirus[J]. Arch Virol，2004，149：625-632.
[8]Wang J，Liu Z，Niu S，et a1. Natural occurrence of Chilli veinal mottle virus on Capsicum chinense in China[J]. Plant Disease，2006，90（3）：377.
[9]Tan G T，Shi L L，Shang H L，et a1.Diagnosis of viruses in chili pepper in Shanxi Province[J]. China Capsicum，2003，3：32.
[10]Ding M，Yang C，Zhang L，et a1.Occurrence of Chilli veinal mottle virus in Nicotiana tabacum in Yunnan，China[J]. Plant Disease，2011，95（3）：357.
[11]K. Tamura，D. Peterson，N. Peterson，et a1. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28：2731-2739 .
[12]Nono-Womdim R.An overview of major virus diseases of vegetable crops in Africa and some aspects of their control[M]//Hughes J，Odu B. Plant virology in sub-Saharan Africa.Ibadan：International Institute for Tropical Agriculture，2004：211-232.朱弘元，康健，范昕，等. 解淀粉芽孢杆菌B15产脂肽的分离鉴定及抑菌机理[J]. 江苏农业科学，2016，44（5）：186-189.
关键词：辣椒脉斑驳病毒；检测；CP基因；系统发育分析
中图分类号： S436.418.1 9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0184-02
辣椒，一种茄科辣椒属植物，原产于中南美洲热带地区，在全世界都有广泛栽培，是世界上消费量最大的蔬菜之一。我国辣椒种植面积高达140万hm2以上，占据我国所有蔬菜作物种植面积的10%[1]。辣椒病毒病是威胁辣椒安全生产的重要病害，目前能够侵染辣椒的病毒有40多种[2-3]，其中辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）是危害辣椒作物的最主要病毒之一；该病毒于1979年首次在马来半岛的辣椒作物上被发现[4]，随后在世界上许多国家的辣椒作物上陆续被报道[5-7]。ChiVMV主要依靠蚜虫进行非持久性传播[4]，还能通过病株汁液和机械接触等方式传播，不能通过种子传播，因此，其传播扩散速度非常快。
在我国，ChiVMV首先在海南省被报道，严重危害海南的黄灯笼椒[8]，随后在陕西、云南等地区相继发生[8-10]。然而，到目前为止，尚未见ChiVMV在湖南以及福建等地区的报道。鉴于ChiVMV对辣椒生产的威胁，本研究检测了湖南和福建等地辣椒上ChiVMV的发生情况，克隆了湖南和福建等地ChiVMV株系的CP基因，并分析了其系统发育关系，以期为明确我国ChiVMV的分布及遗传进化提供科学依据。
1材料与方法
1.1供试材料
辣椒样品：2013年8月，在湖南省和福建省进行辣椒病毒病调查，发现部分地块辣椒病毒病的发病症状与ChiVMV类似，表现为植株矮小，叶片畸形（包括叶片黄化、叶卷曲、叶面枯斑、叶沿皱缩等）。采集湖南省辣椒样本16个、福建省辣椒样本8个。
ChiVMV ELISA检测试剂盒购自美国RB公司；cDNA试剂盒、DNTP、氨苄青霉素、EASY Taq DNA聚合酶和DNA回收试剂盒均购自北京全氏金生物技术有限公司，Trizol试剂盒购自Ambion公司，Elisa试剂盒购自RP公司；供试引物由华大基因公司合成，DNA测序测定由生物工程（上海）有限公司完成。
1.2ELISA检测
ELISA检测具体操作步骤按说明书进行。阳性对照为试剂盒自带ChiVMV病毒初提纯物；阴性对照为温室内健康辣椒苗的研磨液。
1.3RT-PCR
Trizol法抽提辣椒叶片总RNA，取500 ng总RNA，采用 All-in-one First-Strand cDNA合成试剂盒合成cDNA。以合成 cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，34个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增引物ChiVMV CP特异性引物，CPF（5′-GCGGGAGAGAGTGTTGATGCTG-3′），CPR（5′-TCGCCACTATTGAACAGCTTAAC-3′）；1.0%琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物，回收符合预期大小的条带，送生工生物工程（上海）有限公司测序。
1.4序列进化分析
从Genbank数据库中下载了9个ChiVMV典型分离物的CP基因序列。利用CLUSTAL W对所有CP序列进行多序列联配，利用Mega 5.0采用邻接法，构建ChiVMV CP 基因的系统发育树[11]。
2结果与分析
2.1ChiVMV ELISA检测
ELISA检测结果表明，从湖南采集的16个辣椒样本中，共有4个样本呈现阳性；而从福建采集的8个样本中，检测出2个阳性样本。
2.2ChiVMV CP基因克隆与序列分析
RT-PCR结果表明，扩增得到大小为1 100 bp的条带（含ChiVMV CP全基因序列以及部分上游基因序列），与预期大小一致。将RT-PCR扩增得到的条带进行序列测定，截取ChiVMV CP基因序列，输入NCBI进行比对，比对结果表明，福建和湖南等地的ChiVMV株系CP基因与来源于韩国辣椒的ChiVMV序列同源性最高（>97%）。
2.3序列的系统发育分析
从ChiVMV-hn和ChiVMV-fj的系统发育树（图1）可以看出，发育树共分成3个分支，分别为韩国株系分支、印度株系分支和中国株系分支，具有很强的地域性；而ChiVMV-hn和ChiVMV-fj与韩国的2个分离物（AJ972878.1和AM909717.1）构成1个分支，表明湖南和福建等地的ChiVMV株系与韩国ChiVMV的亲缘关系较近。系统发育分析还表明，我国辣椒上的ChiVMV具有遗传分化的趋势。
3结论
ChiVMV是一种（ ）ssRNA病毒，是Potyvirus Y病毒属的确定种，该病毒的存在严重制约着韩国、印度、泰国等国和我国台湾等地的辣椒生产，是造成这些地方辣椒减产的最主要原因之一[4，12]。本研究采用ELISA以及RT-PCR方法在湖南省和福建省等地的辣椒病样检测到ChiVMV，表明ChiVMV在我国的侵染范围正逐步扩展，对我国辣椒的生产具有潜在的威胁。 ChiVMV湖南和福建等地的CP基因序列的系统发育分析显示，我国的ChiVMV存在遗传分化的趋势；由于ChiVMV不同株系对辣椒的致病性存在差异，因此，我国ChiVMV的株系分化情况，急需开展进一步的研究，为分析ChiVMV对辣椒的危害提供科学依据，同时为该病毒的科学防控提供科学参考。
参考文献：
[1]孙国胜，马志虎，孙春青，等. 早春辣椒连作免耕栽培技术[J]. 中国蔬菜，2015，28（1）：55-56.
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[3]Green S K，Kim J S.Characteristics and control of viruses infecting peppers：a literature review[R]. Taiwan：Asian Vegetable Research and Development Center，1991.
[4]Ong C A，Varghese G，Ting W P. Aetiological investigations on a veinal mottle virus of chill（Capsicum annuum L.）newly recorded from peninsula Malaysia[J]. Mardi Res Bull，1979，7：78-88.
[5]Chiemsombat P，Sac-Ung N，Attathom S，et a1.Molecular taxonomy of a new potyvirus isolated from chilli pepper in Thailand[J]. Archive of Virology，1998，143（10）：1855-1863.
[6]Nono-Womdim R，Swai I S，Chadha M L，et a1.Occurrence of Chilli veinal mottle virus in Solanum aethiopicum in Tanzania[J]. Plant Disease，2001，85（7）：801-801.
[7]Anindya R，Joseph J，Gowri T D S，et a1.Complete genomic sequence of pepper vein banding virus（PVBV）：a distinct member of the genus Potyvirus[J]. Arch Virol，2004，149：625-632.
[8]Wang J，Liu Z，Niu S，et a1. Natural occurrence of Chilli veinal mottle virus on Capsicum chinense in China[J]. Plant Disease，2006，90（3）：377.
[9]Tan G T，Shi L L，Shang H L，et a1.Diagnosis of viruses in chili pepper in Shanxi Province[J]. China Capsicum，2003，3：32.
[10]Ding M，Yang C，Zhang L，et a1.Occurrence of Chilli veinal mottle virus in Nicotiana tabacum in Yunnan，China[J]. Plant Disease，2011，95（3）：357.
[11]K. Tamura，D. Peterson，N. Peterson，et a1. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28：2731-2739 .
[12]Nono-Womdim R.An overview of major virus diseases of vegetable crops in Africa and some aspects of their control[M]//Hughes J，Odu B. Plant virology in sub-Saharan Africa.Ibadan：International Institute for Tropical Agriculture，2004：211-232.朱弘元，康健，范昕，等. 解淀粉芽孢杆菌B15产脂肽的分离鉴定及抑菌机理[J]. 江苏农业科学，2016，44（5）：186-189.