论文部分内容阅读
摘要 为明确山东肥城桃种植区桃树上主要存在的病毒和类病毒及其发生情况，采集具有花叶、斑驳和皱缩典型症状的肥城桃样品，提取叶片总RNA后，分别选用桃树上已报道的啤酒花矮化类病毒Hop stunt viroid （HSVd）、桃潜隐花叶类病毒Peach latent mosaic viroid （PLMVd）、苹果褪绿叶斑病毒Apple chlorotic leaf spot virus （ACLSV）、樱桃锉叶病毒Cherry rasp leaf virus （CRLV）、桃花叶病毒Peach mosaic virus （PMV）、李属坏死环斑病毒Prunus necrotic ringspot virus （PNRSV）、李痘病毒Plum pox virus （PPV）、李矮缩病毒Prunus dwarf virus （PDV）、樱桃绿环斑驳病毒Cherry green ring mottle virus （CGRMV）、杏假褪绿叶斑病毒Apricot pseudochlorotic leaf spot virus （APCLSV）、李树皮坏死茎纹孔伴随病毒Plum bark necrosis stem pittingassociated virus （PBNSPaV）和小樱桃病毒1号Little cherry virus 1 （LchV1）的特异性引物进行RTPCR检测。PCR结果显示仅HSVd、PLMVd、ACLSV、PNRSV和PBNSPaV的扩增产物中得到了预期大小的目的片段，将目的片段克隆测序后，经NCBI BLAST比对发现，山东肥城桃分离物HSVd、PLMVd、ACLSV、PNRSV和PBNSPaV与GenBank已报道分离物序列一致性均达90%以上。表明山东肥城桃已感染HSVd 、PLMVd 2种类病毒和ACLSV、PNRSV、PBNSPaV 3种病毒。
关键词 肥城桃； 病毒； 类病毒； RTPCR； 序列分析
中图分类号： S432.41
文献标识码： A
DOI： 10.3969/j.issn.05291542.2017.02.025
Abstract To investigate field occurrence and causing agents of virus and viroid diseases on Feicheng peach in the main planting areas in Shandong Province， peach leaf samples with typical symptoms of mosaic， mottled and shrinking reminiscent of virus and viroid infection were collected from Feicheng peach orchard. After extracting total RNA， specific primers of Hop stunt viroid （HSVd）， Peach latent mosaic viroid （PLMVd）， Apple chlorotic leaf spot virus （ACLSV）， Cherry rasp leaf virus （CRLV）， Peach mosaic virus （PMV）， Prunus necrotic ringspot virus （PNRSV）， Plum pox virus （PPV）， Prunus dwarf virus （PDV）， Cherry green ring mottle virus （CGRMV）， Apricot pseudochlorotic leaf spot virus （APCLSV）， Plum bark necrosis stem pittingassociated virus （PBNSPaV）and Little cherry virus 1 （LchV1 ） were applied for RTPCR detection. Only five expected segments specific to HSVd， PLMVd， ACLSV， PNRSV and PBNSPaV were obtained. PCR products were cloned and sequenced. BLAST analysis showed that sequences of Feicheng peach isolates of HSVd， PLMVd， ACLSV， PNRSV and PBNSPaV shared similarities higher than 90% with those of the corresponding domestic isolates deposited in GenBank. Our results demonstrated that Feicheng peach trees were infected by HSVd， PLMVd， ACLSV， PBNSPaV and PNRSV.
Key words Feicheng peach； virus； viroid； RTPCR； sequence analysis
桃樹被病毒侵染后，症状表现为叶片出现褪绿斑、斑驳、环斑、皱缩、花叶，枝条节间缩短变粗和茎穴等[1]，且症状会随病毒株系、寄主感病性、气候条件等的变化而变化，可导致嫁接不亲合、发芽率低、开花延迟、树势衰退、产量下降、品质变劣甚至死亡[2]。类病毒是一类无外壳蛋白包裹、能够进行自我复制的单链闭合环状RNA分子，由Diener于1971年首次发现，是迄今为止发现的最小病原物[3]。据报道，目前侵染桃树的类病毒主要有啤酒花矮化类病毒（HSVd）和桃潜隐花叶类病毒（PLMVd）[48]，分别首次发现于日本和法国[910]。 中国是一个桃树病毒病发生较严重的国家[1113]，但关于桃树病毒病在我国的地理分布以及侵染情况研究的相关报道较少。山东肥城是我国的桃主产区之一，但山东肥城桃树是否被报道的两种类病毒和其他病毒侵染，及病害发生危害情况如何至今尚未见报道。桃树感染病毒后，植株症状表现不明显、潜伏期长、危害性大，并可通过嫁接、修剪等田间农事操作进行传播。植株一旦感病，就会加快病毒传播蔓延的速度，防治难度大大增加[14]。
自2013年以来，山东肥城桃园中发现了花叶、斑驳和皱缩等症状的桃叶，为明确具有上述症状的桃树中可能存在的病毒或类病毒种类，本研究在调查侵染山东肥城桃树的病毒种类及发生分布的同时，采用分子生物学方法，将分离得到的类病毒、病毒进行克隆、测序及序列分析，为了解肥城桃病毒病害的多样性、检测和防治奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集
2013年4月-2015年4月，在山东肥城市新城办事处中央桃行和仪阳乡刘台村两个肥城桃主产区采集具有花叶、皱缩、斑驳症状的肥城桃样品共236份，其中中央桃行120份，仪阳乡刘台村116份，将采集的样品保存于-20℃冰箱，以未感病的健康肥城桃叶片作为阴性对照。
1.1.2 菌株、载体及试验试剂
大肠杆菌Escherichia coli DH5α菌株由山东省蔬菜病虫生物学重点实验室提供；RNase Inhibitor、RTase MMLV（RNase H-）、T4 DNA连接酶和克隆载体pMD18T购自TaKaRa公司；DNA回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；Easy Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量标准Trans2K Plus购自北京全式金生物技术有限公司；特异性引物交由上海博尚生物技术有限公司合成；其余生化试剂和普通化学试剂为进口或国产分析纯。
1.1.3 仪器
台式高速冷冻离心机（5417R德国Eppendorf）、PCR扩增仪（美国伯乐）、电子天平（瑞士普利赛斯Precisa）、EC25090核酸电泳仪（ECApparatus Corporation）DYY6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）、JY04S3E型凝胶成像系统（北京君意东方电泳设备有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取及二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2DPAGE）检测
称取待测样品叶片0.1 g，加液氮后迅速研磨成粉末状，用TRIzol法提取叶片总RNA，用于后续试验及cDNA的合成。
为初步判断所采集的桃树样品中是否携带类病毒，利用二维聚丙烯凝胶电泳检测提取的纯总RNA。首先用1×TAE进行5%丙烯酰胺非变性凝胶电泳，将含类病毒泳道胶切下，转移至新制的5%丙烯酰胺变性凝胶（含尿素）底部，在变性条件下继续电泳，当二甲苯腈到达距顶端约1/4时停止电泳，取出凝胶，用银染法染色。
1.2.2 RTPCR扩增
cDNA的合成：反转录体系（10 μL）包括模板RNA 3.0 μL，特异性下游引物（表1）各 1.0 μL，RNaseFree H2O 2.0 μL，70℃变性10 min，冰上急冷2 min后，加入下列试剂：5×MMLV Buffer 2 μL，dNTP mixture （各10 mmol/L）和RNase MMLV（RNase H-，200 U/μL）各0.5 μL，RNase Inhibitor（40 U/μL）0.25 μL，总体系至10 μL。42℃保温60 min，再70℃保温15 min。
PCR扩增：以上述不同引物合成的cDNA为模板，分别进行PCR扩增，扩增体系如下：10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 1.0 μL，HSVd、PLMVd、ACLSV、CRLV、PMV、PNRSV、PPV、PDV、CGRMV、APCLSV、PBNSPaV和LchV1的特异性上下游引物各1.0 μL，cDNA 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，ddH2O 补足总体积至25 μL。扩增条件：94℃ 3 min；94℃ 30 s；53℃ 30 s；72℃ 1 min；循环25次；72℃ 10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照记录结果。
1.2.3 PCR产物回收、测序及序列分析
按照试剂盒说明纯化目的片段。纯化后的PCR产物连接至pMD18T并转化DH5α，用含氨苄青霉素（Amp）的培养基进行筛选。经PCR验证为阳性的克隆，取其菌液进行序列测定。将获得的序列与GenBank中的序列进行BLAST比对，同时下载NCBI上典型分离物序列，采用MEGA 4软件的邻接法（neighborjoining，NJ），对选定的序列进行系统进化树构建，并将其中的各分支置信度（bootstrap）进行1 000次重复分析。
2 结果与分析
2.1 肥城桃叶样品携带类病毒的检测
经2DPAGE检测，观察到前后两条带较为清晰，并且條带亮度明显不同（图1）。表明被检测样品中含有分子量大小不同的两种类病毒，且在寄主体内的含量也不相同。根据已报道的啤酒花矮化类病毒（HSVd）和桃潜隐花叶类病毒（PLMVd）序列大小不同这一信息，可以初步判断肥桃叶片中含有HSVd和PLMVd两种类病毒，为明确其具体发生情况，进一步采用RTPCR进行鉴定。
2.2 肥城桃叶片病毒、类病毒的RTPCR检测
从山东肥城市新城办事处中央桃行和仪阳乡刘台村两个肥城桃主产区肥城桃叶片上共检测到了HSVd、PLMVd两种类病毒，ACLSV、PBNSPaV和PNRSV 3种病毒（表2），两种类病毒在中央桃行桃产区分布多于刘台产区，其中PLMVd的阳性样品数量大于HSVd。PLMVd、HSVd、ACLSV和PBNSPaV带毒率分别为23.3%、9.3%、23.3%、5.5%和6.8%，其中HSVd、PLMVd和ACLSV 3种病毒伴有复合侵染现象，以PLMVd与HSVd复合侵染较多，PLMVd与ACLSV、HSVd与ACLSV复合侵染次之，PBNSPaV和PNRSV无复合侵染现象。 2.2.1 肥城桃类病毒RTPCR检测
以桃树叶片总RNA为模板，分别用HSVd特异引物HSVdP2f/P3r和PLMVd特异性引物PLMVdP13/P14进行RTPCR扩增。结果显示，在部分样品中可分别扩增出大小为306 bp（KJ754184）和341 bp（KJ754183）的HSVd和PLMVd特异条带（图2a～b）。HSVd山东肥城桃分离物SDH1（KJ754184）与GenBank中登录的其他HSVd分离物相似性在93.4%～97.8%之间，其中与HSVd法国分离物F1（KF712280）相似性最高，为97.8%；PLMVd山东肥城桃分离物SDP2（KJ754183）与GenBank已报道的PLMVd典型分离物之间的相似性为96.3%～98.4%，其中与PLMVd北京分离物BJ1（JF898787）相似性最高，为98.4%。
2.2.2 肥城桃病毒RTPCR检测
采用ACLSV、PBNSPaV和PNRSV特异引物ACLSV5/3、PBNSPa3fc/2rc和PNRSVF/R分别进行RTPCR扩增。结果显示，在部分样品中分别得到大小为566 bp（KJ754185）、531 bp（KU204711）和675 bp（KU179193）的特异性条带（图3a～c），与GenBank已报道的ACLSV、PBNSPaV和PNRSV的典型分离物之间相似性达到90%以上，其中ACLSV山东肥城桃SDA3分离物与北京分离物ST4（JN848995）相似性最高，达94.4%，PBNSPaV山东肥城桃分离物SDPBNSPaV与湖北武汉分离物PchLN21（KJ792838）相似性最高，为94.5%，PNRSV山东肥城桃分离物SDPNRSV与智利分离物NctCl.ear1（EF565252）相似性最高，为99.9%。
2.3 序列分析
为了更好地分析肥城桃叶携带病毒或类病毒的系统进化关系，选择GenBank中不同地区有代表性的HSVd、PLMVd、ACLSV、PBNSPaV和PNRSV分离物序列，构建系统进化树（图4）。结果表明，HSVd山东肥城桃分离物SDH1与法国分离物F1（KF712280）亲缘关系最近（图4a）；PLMVd山东肥城桃分离物SDP2与北京分离物BJ1（JF898787）亲缘关系最近（图4b）；ACLSV山东肥城桃分离物SDA3与北京分离物ST4（JN848995）亲缘关系最近（图4c）；PBNSPaV山东肥城桃分离物SDPBNSPaV与湖北武汉分离物PchLN21（KJ792838）亲缘关系最近（图4d）；PNRSV山东肥城桃分离物SDPNRSV与智利分离物NctCl.ear1（EF565252）親缘关系最近（图4e）。
3 结论与讨论
目前桃树上已发现的病毒主要有李属坏死环斑病毒（PNRSV）、李痘病毒（PPV）、李矮缩病毒（PDV）、樱桃绿环斑驳病毒（CGRMV）、杏假褪绿叶斑病毒（APCLSV）、李树皮坏死茎纹孔伴随病毒（PBNSPaV）、小樱桃病毒1号（LchV1）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、樱桃锉叶病毒（CRLV）、桃花叶病毒等（PMV）。侵染桃树的类病毒主要有两种，分别为桃潜隐花叶类病毒（PLMVd）和啤酒花矮化类病毒（HSVd）[12，2528]。2011-2012年于云[23]在山东省检测到侵染桃树的病毒主要有樱桃绿环斑驳病毒（CGRMV）、杏假褪绿叶斑病毒（APCLSV）和苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）3种，但是未对山东肥城桃主产区的病毒病进行系统检测；2007年周莹[15]在山东省桃树上仅检测到桃潜隐花叶类病毒（PLMVd）一种类病毒。本研究在前人的基础上，对山东肥城桃树上可能存在的、目前侵染桃树的2种类病毒和10种病毒进行全面系统的检测，为了解肥城桃病毒病害的多样性及病原检测和防治奠定基础。
山东肥城桃栽培面积已超过4 000 hm2，本研究通过对肥城桃主产区连续3年的检测，确定肥城桃上发生啤酒花矮化类病毒（HSVd）和桃潜隐花叶类病毒（PLMVd） 2种类病毒和苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、李树皮坏死茎纹孔伴随病毒（PBNSPaV）、李属坏死环斑病毒（PNRSV） 3种病毒的侵染，发生比例较高，且部分病毒伴有复合侵染现象。由于病毒、类病毒一旦侵染桃树，将终生带毒，这将对肥城桃产业的健康持续发展带来潜在风险，必须引起足够重视并采取相应的预警措施。
参考文献
[1] 阮小凤， 周瑗月， 马书尚， 等. 桃病毒病调查与检测研究[J]. 西北农业学报， 1998， 7（3）： 5962.
[2] 刘建， 杨莉莉. 侵染桃树的病毒、类病毒和植原体病害研究进展[J]. 果树科学， 1999， 16（S1）： 2731.
[3] Diener T O. Viroids： the smallest known agents of infectious disease [J]. Annual Review of Microbiology， 1974， 28： 2339.
[4] 范宏艳. 桃树类病毒发生率调查及PLMVd基因多样性分析[D]. 长春： 吉林农业大学， 2011.
[5] 周莹，李世访，成卓敏，等.桃树上啤酒花矮化类病毒（Hop stunt viroid）的检测及序列分析[J].植物病理学报，2006，36（6）：501507.
[6] 杨元爱， 李世访， 成卓敏， 等. 杏和李树啤酒花矮化类病毒的检测与序列分析[J]. 园艺学报， 2006， 33（6）： 11931198.
[7] 徐文兴， 王国平， 洪霓. 桃潜隐花叶类病毒RTPCR和分子杂交检测技术的建立[J]. 植物检疫， 2005， 19（5）： 268271. [8] 张少瑜， 张尊平， 洪霓， 等. 桃潜隐花叶类病毒的鉴定[J]. 中国果树， 2000 （1）： 3031.
[9] Sano T， Hataya T， Terai Y， et al. Hop stunt viroid strains from dapple fruit disease of plum and peach in Japan [J]. Journal of General Virology， 1989， 70（6）： 13111319.
[10]Desvignes J C. Peach latent mosaic and its relation to peach yellow mosaic virus disease [J]. Acta Horticulture， 1986， 193： 5157.
[11]董晓民， 张毅， 刘伟， 等. 桃病毒病及检测技术研究进展[J]. 北方园艺， 2016 （3）： 199203.
[12]李世访， 卢美光. 桃树病毒病研究现状与防控对策[J]. 中国果业信息， 2013， 30 （10）： 8081.
[13]王国平，洪霓. 我国果树病毒病发生危害现状与防治对策[J]. 北方果树， 1997 （3）： 810
[14]王国平， 洪霓. 果树病毒检测与脱除技术的研究进展[J]. 华中农业大学学报， 2004， 23（6）： 685691.
[15]周莹. 桃树类病毒鉴定及序列多样性分析[D]. 北京： 中国农业科学院， 2007.
[16]Park H L， Yoon J S， Kim H R， et al. Multiplex RTPCR assay for the detection of Apple stem grooving virus and Apple chlorotic leaf spot virus in infected Korean apple cultivars [J]. Plant Pathology Journal， 2006， 22（2）： 168173.
[17]James D， Upton C. Genome segment RNA1 of a flat apple isolate of Cherry rasp leaf virus： nucleotide sequence analysis and RTPCR detection[J]. Archives of Virology， 2005， 150（7）： 14691476.
[18]James D， Upton C. Single primer pair designs that facilitate simultaneous detection and differentiation of peach mosaic virus and cherry mottle leaf virus [J]. Journal of Virological Methods， 1999， 83（1）： 103111.
[19]Marais A， Faure C， Couture C， et al. Characterization by deep sequencing of divergent Plum bark necrosis stem pittingassociated virus （PBNSPaV） isolates and development of a broadspectrum PBNSPaV detection assay[J]. Phytopathology， 2014， 104（6）： 660666.
[20]王文文， 宗曉娟， 陈立伟， 等. 山东地区樱桃绿环斑驳病毒（CGRMV） 的 RTPCR检测及外壳蛋白基因的克隆[J]. 山东农业大学学报（自然科学版）， 2012， 43（2）： 206210.
[21]周灼标， 郑雷青， 管维， 等. 用二重PCR方法检测李痘病毒和李坏死环斑病毒[J]. 植物保护， 2006， 32（4）： 107109.
[22]陈立伟， 宗晓娟， 王文文， 等. 李矮缩病毒外壳蛋白基因克隆及原核表达研究[J]. 中国农学通报， 2012， 28（12）： 177181.
[23]于云. 多重RTPCR技术检测桃病毒的研究[D]. 福州： 福建农林大学， 2012.
[24]Lim S， Igori D， Yoo R H， et al. Genomic detection and characterization of a Korean isolate of Little cherry virus 1 sampled from a peach tree [J]. Virus Genes， 2015， 51（2）： 260266.
[25]赵晓丽， 周琦， 孙宁， 等. 啤酒花矮化类病毒实时荧光定量RTPCR检测方法的建立与应用[J]. 植物保护学报， 2013， 40（4）： 309314.
[26]Ding B.The biology of viroidhost interactions [J]. Annual of Review Phytopathology， 2009， 47： 105131.
[27]Hassan M， Zouhar M， Rysanek P. Development of a PCR method of Peach latent mosaic viroid detection for certification of planting material [J]. Acta Horticulturae， 2004， 657： 392395.
[28]Huttinga H. Sensitivity of indexing procedures for viruses and viroids [J]. Advances in Botanical Research， 1996， 23： 5971.
（责任编辑：杨明丽）
关键词 肥城桃； 病毒； 类病毒； RTPCR； 序列分析
中图分类号： S432.41
文献标识码： A
DOI： 10.3969/j.issn.05291542.2017.02.025
Abstract To investigate field occurrence and causing agents of virus and viroid diseases on Feicheng peach in the main planting areas in Shandong Province， peach leaf samples with typical symptoms of mosaic， mottled and shrinking reminiscent of virus and viroid infection were collected from Feicheng peach orchard. After extracting total RNA， specific primers of Hop stunt viroid （HSVd）， Peach latent mosaic viroid （PLMVd）， Apple chlorotic leaf spot virus （ACLSV）， Cherry rasp leaf virus （CRLV）， Peach mosaic virus （PMV）， Prunus necrotic ringspot virus （PNRSV）， Plum pox virus （PPV）， Prunus dwarf virus （PDV）， Cherry green ring mottle virus （CGRMV）， Apricot pseudochlorotic leaf spot virus （APCLSV）， Plum bark necrosis stem pittingassociated virus （PBNSPaV）and Little cherry virus 1 （LchV1 ） were applied for RTPCR detection. Only five expected segments specific to HSVd， PLMVd， ACLSV， PNRSV and PBNSPaV were obtained. PCR products were cloned and sequenced. BLAST analysis showed that sequences of Feicheng peach isolates of HSVd， PLMVd， ACLSV， PNRSV and PBNSPaV shared similarities higher than 90% with those of the corresponding domestic isolates deposited in GenBank. Our results demonstrated that Feicheng peach trees were infected by HSVd， PLMVd， ACLSV， PBNSPaV and PNRSV.
Key words Feicheng peach； virus； viroid； RTPCR； sequence analysis
桃樹被病毒侵染后，症状表现为叶片出现褪绿斑、斑驳、环斑、皱缩、花叶，枝条节间缩短变粗和茎穴等[1]，且症状会随病毒株系、寄主感病性、气候条件等的变化而变化，可导致嫁接不亲合、发芽率低、开花延迟、树势衰退、产量下降、品质变劣甚至死亡[2]。类病毒是一类无外壳蛋白包裹、能够进行自我复制的单链闭合环状RNA分子，由Diener于1971年首次发现，是迄今为止发现的最小病原物[3]。据报道，目前侵染桃树的类病毒主要有啤酒花矮化类病毒（HSVd）和桃潜隐花叶类病毒（PLMVd）[48]，分别首次发现于日本和法国[910]。 中国是一个桃树病毒病发生较严重的国家[1113]，但关于桃树病毒病在我国的地理分布以及侵染情况研究的相关报道较少。山东肥城是我国的桃主产区之一，但山东肥城桃树是否被报道的两种类病毒和其他病毒侵染，及病害发生危害情况如何至今尚未见报道。桃树感染病毒后，植株症状表现不明显、潜伏期长、危害性大，并可通过嫁接、修剪等田间农事操作进行传播。植株一旦感病，就会加快病毒传播蔓延的速度，防治难度大大增加[14]。
自2013年以来，山东肥城桃园中发现了花叶、斑驳和皱缩等症状的桃叶，为明确具有上述症状的桃树中可能存在的病毒或类病毒种类，本研究在调查侵染山东肥城桃树的病毒种类及发生分布的同时，采用分子生物学方法，将分离得到的类病毒、病毒进行克隆、测序及序列分析，为了解肥城桃病毒病害的多样性、检测和防治奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集
2013年4月-2015年4月，在山东肥城市新城办事处中央桃行和仪阳乡刘台村两个肥城桃主产区采集具有花叶、皱缩、斑驳症状的肥城桃样品共236份，其中中央桃行120份，仪阳乡刘台村116份，将采集的样品保存于-20℃冰箱，以未感病的健康肥城桃叶片作为阴性对照。
1.1.2 菌株、载体及试验试剂
大肠杆菌Escherichia coli DH5α菌株由山东省蔬菜病虫生物学重点实验室提供；RNase Inhibitor、RTase MMLV（RNase H-）、T4 DNA连接酶和克隆载体pMD18T购自TaKaRa公司；DNA回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；Easy Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量标准Trans2K Plus购自北京全式金生物技术有限公司；特异性引物交由上海博尚生物技术有限公司合成；其余生化试剂和普通化学试剂为进口或国产分析纯。
1.1.3 仪器
台式高速冷冻离心机（5417R德国Eppendorf）、PCR扩增仪（美国伯乐）、电子天平（瑞士普利赛斯Precisa）、EC25090核酸电泳仪（ECApparatus Corporation）DYY6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）、JY04S3E型凝胶成像系统（北京君意东方电泳设备有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取及二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2DPAGE）检测
称取待测样品叶片0.1 g，加液氮后迅速研磨成粉末状，用TRIzol法提取叶片总RNA，用于后续试验及cDNA的合成。
为初步判断所采集的桃树样品中是否携带类病毒，利用二维聚丙烯凝胶电泳检测提取的纯总RNA。首先用1×TAE进行5%丙烯酰胺非变性凝胶电泳，将含类病毒泳道胶切下，转移至新制的5%丙烯酰胺变性凝胶（含尿素）底部，在变性条件下继续电泳，当二甲苯腈到达距顶端约1/4时停止电泳，取出凝胶，用银染法染色。
1.2.2 RTPCR扩增
cDNA的合成：反转录体系（10 μL）包括模板RNA 3.0 μL，特异性下游引物（表1）各 1.0 μL，RNaseFree H2O 2.0 μL，70℃变性10 min，冰上急冷2 min后，加入下列试剂：5×MMLV Buffer 2 μL，dNTP mixture （各10 mmol/L）和RNase MMLV（RNase H-，200 U/μL）各0.5 μL，RNase Inhibitor（40 U/μL）0.25 μL，总体系至10 μL。42℃保温60 min，再70℃保温15 min。
PCR扩增：以上述不同引物合成的cDNA为模板，分别进行PCR扩增，扩增体系如下：10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 1.0 μL，HSVd、PLMVd、ACLSV、CRLV、PMV、PNRSV、PPV、PDV、CGRMV、APCLSV、PBNSPaV和LchV1的特异性上下游引物各1.0 μL，cDNA 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，ddH2O 补足总体积至25 μL。扩增条件：94℃ 3 min；94℃ 30 s；53℃ 30 s；72℃ 1 min；循环25次；72℃ 10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照记录结果。
1.2.3 PCR产物回收、测序及序列分析
按照试剂盒说明纯化目的片段。纯化后的PCR产物连接至pMD18T并转化DH5α，用含氨苄青霉素（Amp）的培养基进行筛选。经PCR验证为阳性的克隆，取其菌液进行序列测定。将获得的序列与GenBank中的序列进行BLAST比对，同时下载NCBI上典型分离物序列，采用MEGA 4软件的邻接法（neighborjoining，NJ），对选定的序列进行系统进化树构建，并将其中的各分支置信度（bootstrap）进行1 000次重复分析。
2 结果与分析
2.1 肥城桃叶样品携带类病毒的检测
经2DPAGE检测，观察到前后两条带较为清晰，并且條带亮度明显不同（图1）。表明被检测样品中含有分子量大小不同的两种类病毒，且在寄主体内的含量也不相同。根据已报道的啤酒花矮化类病毒（HSVd）和桃潜隐花叶类病毒（PLMVd）序列大小不同这一信息，可以初步判断肥桃叶片中含有HSVd和PLMVd两种类病毒，为明确其具体发生情况，进一步采用RTPCR进行鉴定。
2.2 肥城桃叶片病毒、类病毒的RTPCR检测
从山东肥城市新城办事处中央桃行和仪阳乡刘台村两个肥城桃主产区肥城桃叶片上共检测到了HSVd、PLMVd两种类病毒，ACLSV、PBNSPaV和PNRSV 3种病毒（表2），两种类病毒在中央桃行桃产区分布多于刘台产区，其中PLMVd的阳性样品数量大于HSVd。PLMVd、HSVd、ACLSV和PBNSPaV带毒率分别为23.3%、9.3%、23.3%、5.5%和6.8%，其中HSVd、PLMVd和ACLSV 3种病毒伴有复合侵染现象，以PLMVd与HSVd复合侵染较多，PLMVd与ACLSV、HSVd与ACLSV复合侵染次之，PBNSPaV和PNRSV无复合侵染现象。 2.2.1 肥城桃类病毒RTPCR检测
以桃树叶片总RNA为模板，分别用HSVd特异引物HSVdP2f/P3r和PLMVd特异性引物PLMVdP13/P14进行RTPCR扩增。结果显示，在部分样品中可分别扩增出大小为306 bp（KJ754184）和341 bp（KJ754183）的HSVd和PLMVd特异条带（图2a～b）。HSVd山东肥城桃分离物SDH1（KJ754184）与GenBank中登录的其他HSVd分离物相似性在93.4%～97.8%之间，其中与HSVd法国分离物F1（KF712280）相似性最高，为97.8%；PLMVd山东肥城桃分离物SDP2（KJ754183）与GenBank已报道的PLMVd典型分离物之间的相似性为96.3%～98.4%，其中与PLMVd北京分离物BJ1（JF898787）相似性最高，为98.4%。
2.2.2 肥城桃病毒RTPCR检测
采用ACLSV、PBNSPaV和PNRSV特异引物ACLSV5/3、PBNSPa3fc/2rc和PNRSVF/R分别进行RTPCR扩增。结果显示，在部分样品中分别得到大小为566 bp（KJ754185）、531 bp（KU204711）和675 bp（KU179193）的特异性条带（图3a～c），与GenBank已报道的ACLSV、PBNSPaV和PNRSV的典型分离物之间相似性达到90%以上，其中ACLSV山东肥城桃SDA3分离物与北京分离物ST4（JN848995）相似性最高，达94.4%，PBNSPaV山东肥城桃分离物SDPBNSPaV与湖北武汉分离物PchLN21（KJ792838）相似性最高，为94.5%，PNRSV山东肥城桃分离物SDPNRSV与智利分离物NctCl.ear1（EF565252）相似性最高，为99.9%。
2.3 序列分析
为了更好地分析肥城桃叶携带病毒或类病毒的系统进化关系，选择GenBank中不同地区有代表性的HSVd、PLMVd、ACLSV、PBNSPaV和PNRSV分离物序列，构建系统进化树（图4）。结果表明，HSVd山东肥城桃分离物SDH1与法国分离物F1（KF712280）亲缘关系最近（图4a）；PLMVd山东肥城桃分离物SDP2与北京分离物BJ1（JF898787）亲缘关系最近（图4b）；ACLSV山东肥城桃分离物SDA3与北京分离物ST4（JN848995）亲缘关系最近（图4c）；PBNSPaV山东肥城桃分离物SDPBNSPaV与湖北武汉分离物PchLN21（KJ792838）亲缘关系最近（图4d）；PNRSV山东肥城桃分离物SDPNRSV与智利分离物NctCl.ear1（EF565252）親缘关系最近（图4e）。
3 结论与讨论
目前桃树上已发现的病毒主要有李属坏死环斑病毒（PNRSV）、李痘病毒（PPV）、李矮缩病毒（PDV）、樱桃绿环斑驳病毒（CGRMV）、杏假褪绿叶斑病毒（APCLSV）、李树皮坏死茎纹孔伴随病毒（PBNSPaV）、小樱桃病毒1号（LchV1）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、樱桃锉叶病毒（CRLV）、桃花叶病毒等（PMV）。侵染桃树的类病毒主要有两种，分别为桃潜隐花叶类病毒（PLMVd）和啤酒花矮化类病毒（HSVd）[12，2528]。2011-2012年于云[23]在山东省检测到侵染桃树的病毒主要有樱桃绿环斑驳病毒（CGRMV）、杏假褪绿叶斑病毒（APCLSV）和苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）3种，但是未对山东肥城桃主产区的病毒病进行系统检测；2007年周莹[15]在山东省桃树上仅检测到桃潜隐花叶类病毒（PLMVd）一种类病毒。本研究在前人的基础上，对山东肥城桃树上可能存在的、目前侵染桃树的2种类病毒和10种病毒进行全面系统的检测，为了解肥城桃病毒病害的多样性及病原检测和防治奠定基础。
山东肥城桃栽培面积已超过4 000 hm2，本研究通过对肥城桃主产区连续3年的检测，确定肥城桃上发生啤酒花矮化类病毒（HSVd）和桃潜隐花叶类病毒（PLMVd） 2种类病毒和苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、李树皮坏死茎纹孔伴随病毒（PBNSPaV）、李属坏死环斑病毒（PNRSV） 3种病毒的侵染，发生比例较高，且部分病毒伴有复合侵染现象。由于病毒、类病毒一旦侵染桃树，将终生带毒，这将对肥城桃产业的健康持续发展带来潜在风险，必须引起足够重视并采取相应的预警措施。
参考文献
[1] 阮小凤， 周瑗月， 马书尚， 等. 桃病毒病调查与检测研究[J]. 西北农业学报， 1998， 7（3）： 5962.
[2] 刘建， 杨莉莉. 侵染桃树的病毒、类病毒和植原体病害研究进展[J]. 果树科学， 1999， 16（S1）： 2731.
[3] Diener T O. Viroids： the smallest known agents of infectious disease [J]. Annual Review of Microbiology， 1974， 28： 2339.
[4] 范宏艳. 桃树类病毒发生率调查及PLMVd基因多样性分析[D]. 长春： 吉林农业大学， 2011.
[5] 周莹，李世访，成卓敏，等.桃树上啤酒花矮化类病毒（Hop stunt viroid）的检测及序列分析[J].植物病理学报，2006，36（6）：501507.
[6] 杨元爱， 李世访， 成卓敏， 等. 杏和李树啤酒花矮化类病毒的检测与序列分析[J]. 园艺学报， 2006， 33（6）： 11931198.
[7] 徐文兴， 王国平， 洪霓. 桃潜隐花叶类病毒RTPCR和分子杂交检测技术的建立[J]. 植物检疫， 2005， 19（5）： 268271. [8] 张少瑜， 张尊平， 洪霓， 等. 桃潜隐花叶类病毒的鉴定[J]. 中国果树， 2000 （1）： 3031.
[9] Sano T， Hataya T， Terai Y， et al. Hop stunt viroid strains from dapple fruit disease of plum and peach in Japan [J]. Journal of General Virology， 1989， 70（6）： 13111319.
[10]Desvignes J C. Peach latent mosaic and its relation to peach yellow mosaic virus disease [J]. Acta Horticulture， 1986， 193： 5157.
[11]董晓民， 张毅， 刘伟， 等. 桃病毒病及检测技术研究进展[J]. 北方园艺， 2016 （3）： 199203.
[12]李世访， 卢美光. 桃树病毒病研究现状与防控对策[J]. 中国果业信息， 2013， 30 （10）： 8081.
[13]王国平，洪霓. 我国果树病毒病发生危害现状与防治对策[J]. 北方果树， 1997 （3）： 810
[14]王国平， 洪霓. 果树病毒检测与脱除技术的研究进展[J]. 华中农业大学学报， 2004， 23（6）： 685691.
[15]周莹. 桃树类病毒鉴定及序列多样性分析[D]. 北京： 中国农业科学院， 2007.
[16]Park H L， Yoon J S， Kim H R， et al. Multiplex RTPCR assay for the detection of Apple stem grooving virus and Apple chlorotic leaf spot virus in infected Korean apple cultivars [J]. Plant Pathology Journal， 2006， 22（2）： 168173.
[17]James D， Upton C. Genome segment RNA1 of a flat apple isolate of Cherry rasp leaf virus： nucleotide sequence analysis and RTPCR detection[J]. Archives of Virology， 2005， 150（7）： 14691476.
[18]James D， Upton C. Single primer pair designs that facilitate simultaneous detection and differentiation of peach mosaic virus and cherry mottle leaf virus [J]. Journal of Virological Methods， 1999， 83（1）： 103111.
[19]Marais A， Faure C， Couture C， et al. Characterization by deep sequencing of divergent Plum bark necrosis stem pittingassociated virus （PBNSPaV） isolates and development of a broadspectrum PBNSPaV detection assay[J]. Phytopathology， 2014， 104（6）： 660666.
[20]王文文， 宗曉娟， 陈立伟， 等. 山东地区樱桃绿环斑驳病毒（CGRMV） 的 RTPCR检测及外壳蛋白基因的克隆[J]. 山东农业大学学报（自然科学版）， 2012， 43（2）： 206210.
[21]周灼标， 郑雷青， 管维， 等. 用二重PCR方法检测李痘病毒和李坏死环斑病毒[J]. 植物保护， 2006， 32（4）： 107109.
[22]陈立伟， 宗晓娟， 王文文， 等. 李矮缩病毒外壳蛋白基因克隆及原核表达研究[J]. 中国农学通报， 2012， 28（12）： 177181.
[23]于云. 多重RTPCR技术检测桃病毒的研究[D]. 福州： 福建农林大学， 2012.
[24]Lim S， Igori D， Yoo R H， et al. Genomic detection and characterization of a Korean isolate of Little cherry virus 1 sampled from a peach tree [J]. Virus Genes， 2015， 51（2）： 260266.
[25]赵晓丽， 周琦， 孙宁， 等. 啤酒花矮化类病毒实时荧光定量RTPCR检测方法的建立与应用[J]. 植物保护学报， 2013， 40（4）： 309314.
[26]Ding B.The biology of viroidhost interactions [J]. Annual of Review Phytopathology， 2009， 47： 105131.
[27]Hassan M， Zouhar M， Rysanek P. Development of a PCR method of Peach latent mosaic viroid detection for certification of planting material [J]. Acta Horticulturae， 2004， 657： 392395.
[28]Huttinga H. Sensitivity of indexing procedures for viruses and viroids [J]. Advances in Botanical Research， 1996， 23： 5971.
（责任编辑：杨明丽）