【摘 要】
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目的 构建携带绿色荧光(GFP)的X染色体连锁凋亡抑制蛋白基因的重组腺病毒载体(Ad-XIAP)感染体外原代培养老年性聋小鼠模型(C57BL/6J)皮层神经细胞,为后续体内基因治疗实验提
【机 构】
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第三军医大学大坪医院野战外科研究所耳鼻咽喉-头颈外科，重庆，400042
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目的 构建携带绿色荧光(GFP)的X染色体连锁凋亡抑制蛋白基因的重组腺病毒载体(Ad-XIAP)感染体外原代培养老年性聋小鼠模型(C57BL/6J)皮层神经细胞,为后续体内基因治疗实验提供体外研究基础.方法 体外培养C57BL/6J小鼠皮层神经细胞,β-Tubulin鉴定其纯度；利用Ad-Easy载体系统通过细菌内同源重组法构建携带XIAP基因的腺病毒表达载体,筛选鉴定并线性化后获得重组腺病毒载体,TCID50法测定其滴度后转染体外原代培养的皮层神经细胞,观察其感染效率并用RT-PCR检测细胞内XIAP-mRNA表达量.结果 PCR及酶切鉴定穿梭质粒含有XIAP基因,经筛选和鉴定的Ad-XIAP感染皮层神经细胞72 h后观察到细胞携带绿色荧光最强,此时XIAP-mRNA表达量最高.结论 成功构建了携带XIAP基因的高滴度重组腺病毒载体,滴度高、皮层神经细胞感染率大于90％,为后续试验提供了体外研究基础.
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