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在很多竞赛模拟试题中出现：分别使用TTC和红墨水（酸性大红G）染色法对有活力的种子进行染色，预期的结果应该是（ ）
A.两者都能使胚完全染色
B.前者能使胚完全染色，后者不能让胚染色
C.两者都不能使胚完全染色
D.后者能使胚完全染色，前者不能使胚染色
尽管此题是2010和2008年江苏省中学生生物学联赛初赛理论试题，但是不难看出对种子的生命力及细胞死活的鉴定在中学生物学实践中的重要地位。为此，下面通过对种子生命力及细胞死活的鉴定方法作一些小结，以期对高中生物教学有所帮助。
细胞死活的鉴定方法有多种，高中常用的方法有：植物细胞质壁分离法，染色法。由于在直接通过形态观察来鉴别细胞死活过程中，实验结果易受观察者主观因素的影响，因此，实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测。另外还有“EMA-LAMP”方法等。尽管方法原理不同，但本质都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。而建立在细胞死活鉴定基础之上的种子生命力的鉴定方法有：直接观察法、染料（如红墨水等）染色法、氯化三苯基四氮唑法（TIC法）、溴麝香草酚蓝法（BrIB法）等。
1、细胞死活的鉴定
1.1 质壁分离法
成熟的植物细胞一般具有中央大液泡，液泡中的细胞液具有一定的溶质势（或称渗透势），而活的原生质层（包括细胞膜，液泡膜及两层膜之间的细胞质）具有半透性。当细胞与外界溶液接触时，若外界溶液的水势低于细胞液的溶质势（外界溶液浓度大于细胞液浓度），则水分外渗，发生质壁分离，质壁分离的细胞与水或水势较高的溶液接触时，可重新吸水而出现质壁分离复原现象。当植物细胞受到严重伤害或已经死亡时，不能发生质壁分离，因此常用质壁分离法来鉴定细胞的死活。
1.2 染色法
染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，有的染料使死细胞着色，有的使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括以下几点：
（1）死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择透过性膜，对细胞起保护和屏障作用；死细胞的细胞膜受损，通透性增加。常用台盼蓝（锥蓝）染液（质量分数为0.4%）、红墨水（酸性大红G）或伊红Y等染色剂鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。它们能使死细胞着色，而活细胞不被着色。
（2）死活细胞在代谢上的差异：①美蓝（又称亚甲基蓝，品蓝）是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞能进行新陈代谢，使细胞内具有较强的还原性，能使美蓝（常用质量浓度为0.1 mg/mL）从蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，经美蓝染色后活的酵母菌细胞无色，死细胞或代谢缓慢的老细胞，被染成蓝色或淡蓝色。
②荧光素双醋酸酯（FDA）染色，其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异。FDA本身不产生荧光，无极性，能自由穿过完整的细胞膜。当FDA进入活细胞后，被细胞内的脂酶分解，生成有极性的、能产生荧光的物质——荧光素，因该物质不能自由透过细胞膜而积累在细胞膜内，结果导致活细胞产生绿色荧光；死细胞因不能使FDA分解，而无法产生荧光。
（3）对细胞器染色：中性红（3-氨基-7-甲氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐）是一种弱碱性pH指示剂。在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红（常用质量浓度为0.03%）并向液泡中分泌，由于细胞液在一般情况下呈酸性，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，原生质和细胞壁一般不着色。死细胞由于原生质变性凝固，细胞液外渗，因此，死的植物细胞不产生液泡着色现象，并且中性红的阳离子，能与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。
1.3 仪器分析法
可采用微电极技术（利用死活细胞膜两侧电位的差异）、全自动分析细胞记数仪和流式细胞仪等，对细胞的死活进行精确的批量检测。
1.4 EMA-LAMP方法
叠氮溴乙锭（EMA）是一种只能进入死细胞并与DNA分子结合的物质。死细胞暴露于EMA仅仅1 min的时间，EMA便可以渗透细胞壁或细胞膜与其中的DNA结合，使其不能发生扩增反应（图1）。目前，EMA与PCR、Real-time PCR等技术结合，已经被应用于多种病原菌的检测，以提高检测的准确性。
2、种子生命力的鉴定
2.1 直接观察法
植物种子中常含有黄酮类、香豆素类、酚类物质等，能够在紫外光照射下产生荧光。在种子衰老或死亡过程中，荧光的颜色也相应地有所改变。由于生命力衰退或已经死亡细胞的透性增加，当浸泡种子时，容易引起细胞内的荧光物质外渗。因此，可以通过直接观察种胚荧光或观察荧光物质渗出的多少来鉴定种子的生命力。
2.2 染料（如红墨水等）染色法（方法同1.2）
2.3 氯化三苯基四氮唑法（TTC法）
ITC法的其原理是应用Trc的水溶液浸泡种子，使之渗入到种胚的细胞内，有活力的细胞能够进行呼吸代谢，在呼吸代谢途中TTC作为氢受体被脱氢辅酶（NADH2或NADPH2）上的氢还原，可以将无色、质量分数为0.1%的2，3，5-三苯基氯化四唑还原为红色、不溶性的三苯甲腙，而且细胞的生活力越强，代谢活动越旺盛，染色后红色的程度越深。死亡的种子由于没有呼吸作用，因而不会将TTC还原为红色。种胚生活力衰退或部分丧失生活力，染色则会较浅或局部被染色。因此，可以根据种胚染色的部位以及染色的深浅程度来判定种子的生活力的有无与大小。
2.4 溴麝香草酚蓝法（BTB法）
凡活细胞必有呼吸作用，吸收空气中的O2，放出CO2。CO2溶于水成为H2CO3，H2CO3解离成H 和HCO3-，使得胚周围环境的酸度增加，可用酸碱指示剂溴麝香草酚蓝（BTB）来测定酸度的改变。BTB的变色范围为pH 6.0～7.6，酸性呈黄色，碱性呈蓝色，中间经过绿色（变色点为pH7.1）。颜色变化越明显则表明种子活力越强。死细胞没有呼吸作用，也就没有BTB的颜色变化。
3、启示
细胞死活鉴定实验是高中生物常考内容，近年来多次对此知识点的考查正在从识记与理解型向应用与实践型转变，因此要求生物教师要善于把相关知识点进行梳理、总结，化理论为实践，让生物课堂能出现成串的知识点，切实提高课堂教学的效果！
A.两者都能使胚完全染色
B.前者能使胚完全染色，后者不能让胚染色
C.两者都不能使胚完全染色
D.后者能使胚完全染色，前者不能使胚染色
尽管此题是2010和2008年江苏省中学生生物学联赛初赛理论试题，但是不难看出对种子的生命力及细胞死活的鉴定在中学生物学实践中的重要地位。为此，下面通过对种子生命力及细胞死活的鉴定方法作一些小结，以期对高中生物教学有所帮助。
细胞死活的鉴定方法有多种，高中常用的方法有：植物细胞质壁分离法，染色法。由于在直接通过形态观察来鉴别细胞死活过程中，实验结果易受观察者主观因素的影响，因此，实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测。另外还有“EMA-LAMP”方法等。尽管方法原理不同，但本质都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。而建立在细胞死活鉴定基础之上的种子生命力的鉴定方法有：直接观察法、染料（如红墨水等）染色法、氯化三苯基四氮唑法（TIC法）、溴麝香草酚蓝法（BrIB法）等。
1、细胞死活的鉴定
1.1 质壁分离法
成熟的植物细胞一般具有中央大液泡，液泡中的细胞液具有一定的溶质势（或称渗透势），而活的原生质层（包括细胞膜，液泡膜及两层膜之间的细胞质）具有半透性。当细胞与外界溶液接触时，若外界溶液的水势低于细胞液的溶质势（外界溶液浓度大于细胞液浓度），则水分外渗，发生质壁分离，质壁分离的细胞与水或水势较高的溶液接触时，可重新吸水而出现质壁分离复原现象。当植物细胞受到严重伤害或已经死亡时，不能发生质壁分离，因此常用质壁分离法来鉴定细胞的死活。
1.2 染色法
染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，有的染料使死细胞着色，有的使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括以下几点：
（1）死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择透过性膜，对细胞起保护和屏障作用；死细胞的细胞膜受损，通透性增加。常用台盼蓝（锥蓝）染液（质量分数为0.4%）、红墨水（酸性大红G）或伊红Y等染色剂鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。它们能使死细胞着色，而活细胞不被着色。
（2）死活细胞在代谢上的差异：①美蓝（又称亚甲基蓝，品蓝）是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞能进行新陈代谢，使细胞内具有较强的还原性，能使美蓝（常用质量浓度为0.1 mg/mL）从蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，经美蓝染色后活的酵母菌细胞无色，死细胞或代谢缓慢的老细胞，被染成蓝色或淡蓝色。
②荧光素双醋酸酯（FDA）染色，其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异。FDA本身不产生荧光，无极性，能自由穿过完整的细胞膜。当FDA进入活细胞后，被细胞内的脂酶分解，生成有极性的、能产生荧光的物质——荧光素，因该物质不能自由透过细胞膜而积累在细胞膜内，结果导致活细胞产生绿色荧光；死细胞因不能使FDA分解，而无法产生荧光。
（3）对细胞器染色：中性红（3-氨基-7-甲氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐）是一种弱碱性pH指示剂。在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红（常用质量浓度为0.03%）并向液泡中分泌，由于细胞液在一般情况下呈酸性，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，原生质和细胞壁一般不着色。死细胞由于原生质变性凝固，细胞液外渗，因此，死的植物细胞不产生液泡着色现象，并且中性红的阳离子，能与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。
1.3 仪器分析法
可采用微电极技术（利用死活细胞膜两侧电位的差异）、全自动分析细胞记数仪和流式细胞仪等，对细胞的死活进行精确的批量检测。
1.4 EMA-LAMP方法
叠氮溴乙锭（EMA）是一种只能进入死细胞并与DNA分子结合的物质。死细胞暴露于EMA仅仅1 min的时间，EMA便可以渗透细胞壁或细胞膜与其中的DNA结合，使其不能发生扩增反应（图1）。目前，EMA与PCR、Real-time PCR等技术结合，已经被应用于多种病原菌的检测，以提高检测的准确性。
2、种子生命力的鉴定
2.1 直接观察法
植物种子中常含有黄酮类、香豆素类、酚类物质等，能够在紫外光照射下产生荧光。在种子衰老或死亡过程中，荧光的颜色也相应地有所改变。由于生命力衰退或已经死亡细胞的透性增加，当浸泡种子时，容易引起细胞内的荧光物质外渗。因此，可以通过直接观察种胚荧光或观察荧光物质渗出的多少来鉴定种子的生命力。
2.2 染料（如红墨水等）染色法（方法同1.2）
2.3 氯化三苯基四氮唑法（TTC法）
ITC法的其原理是应用Trc的水溶液浸泡种子，使之渗入到种胚的细胞内，有活力的细胞能够进行呼吸代谢，在呼吸代谢途中TTC作为氢受体被脱氢辅酶（NADH2或NADPH2）上的氢还原，可以将无色、质量分数为0.1%的2，3，5-三苯基氯化四唑还原为红色、不溶性的三苯甲腙，而且细胞的生活力越强，代谢活动越旺盛，染色后红色的程度越深。死亡的种子由于没有呼吸作用，因而不会将TTC还原为红色。种胚生活力衰退或部分丧失生活力，染色则会较浅或局部被染色。因此，可以根据种胚染色的部位以及染色的深浅程度来判定种子的生活力的有无与大小。
2.4 溴麝香草酚蓝法（BTB法）
凡活细胞必有呼吸作用，吸收空气中的O2，放出CO2。CO2溶于水成为H2CO3，H2CO3解离成H 和HCO3-，使得胚周围环境的酸度增加，可用酸碱指示剂溴麝香草酚蓝（BTB）来测定酸度的改变。BTB的变色范围为pH 6.0～7.6，酸性呈黄色，碱性呈蓝色，中间经过绿色（变色点为pH7.1）。颜色变化越明显则表明种子活力越强。死细胞没有呼吸作用，也就没有BTB的颜色变化。
3、启示
细胞死活鉴定实验是高中生物常考内容，近年来多次对此知识点的考查正在从识记与理解型向应用与实践型转变，因此要求生物教师要善于把相关知识点进行梳理、总结，化理论为实践，让生物课堂能出现成串的知识点，切实提高课堂教学的效果！