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摘要 [目的]建立一种快速检测猪、牛、羊动物源性成分的实时荧光环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法。[方法]针对猪、牛、羊物种ND1、COXⅠ、cytB特异性基因分别设计LAMP引物，通过实时检测荧光强度判断反应结果。[结果]猪、羊源性成分的检测灵敏度为10 pg，牛源性成分的检测灵敏度为1 pg。对模拟掺杂肉制品检测时，掺杂猪肉、牛肉、羊肉的检出限为0.01%。[结论]该研究所建立的LAMP法特異性强、灵敏度高，能有效地对肉制品掺杂的猪、牛、羊源性成分进行检测，可作为肉类鉴别的一种快速检测方法。
关键词 猪源性成分；牛源性成分；羊源性成分；环介导等温扩增；可视化检测
中图分类号 TS207.3 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）09-0186-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.054
Abstract [Objective] The research aimed to establish a loopmediated isothermal amplification （ LAMP） method for porcin， bovine and sheepderived materials in meat products. [Method]LAMP primers were designed for ND1， COXI and cytB specific genes of pig， cattle and sheep， and the reaction results were judged by realtime detection of fluorescence intensity.[Result]The analytical sensitivity of the LAMP assay for porcin and sheep DNA were 10 pg，1 pg for bovine DNA. The detection limits for adulterated meat products could reach 0.01% for porcin， bovine and sheep.[Conclusion]This method exhibits a very high specificity and sensitivity for porcin， bovine，and sheepderived ingredients and can be used in filed studies ，and does not require any gelelectrophoresis apparatus.
Key words Porcinderived component；Bovinederived component；Sheepderived component；Loopmediated isothermal amplification；Visual detection
2013年的马肉风波在瑞典、德国、法国的部分牛肉中都发现掺杂马肉，国内媒体也多次曝光鸭肉冒充牛羊肉、假肉丸鱼丸等肉类食品掺假事件，肉类食品掺假问题是目前国际国内都比较关注的一个问题，美国《FDA食品安全现代化法案》已将掺假行为列入需要重点防范的食品安全风险之一，为了维护消费者权益，很多国家都对肉类产品含量标示做了明确要求，比如欧盟、美国都要求肉制品需标识所有成分及净含量，我国食品安全法也规定预包装食品包装上应标明名称、净含量、成分配料表等。
肉类掺假是目前研究的一个热点问题，各种检测方法的开发也应运而生，主流的检测方法主要是基于蛋白质和核酸而开发的方法，基于蛋白检测的方法有诸多的局限性，尤其是在深加工食品领域，蛋白在食品加工过程中结构发生了变化，变得不容易被识别，而以核酸为基础的方法就可以避免这些缺点，因为核酸在所有的生物组织基本都存在，在加工过的食品中不容易被降解，仍然可以被检测到，所以以核酸检测为基础的方法应用更为广泛。
目前国家也制定了一些肉类成分鉴定的标准[1-2]，这些标准都是通过DNA的检测技术来制定的，主要采用荧光定量和普通PCR的方法，常需要昂贵的仪器、专业的操作人员。环介导等温扩增技术是2000年日本学者发明的一种新技术，此技术自出现以来在细菌、病毒、转基因等领域得到了广泛的应用[3]，也有很多成型的商品试剂盒，比较适合应用到基层的实验室当中。
笔者根据猪、牛、羊物种ND1、COXⅠ、cytB特异性基因序列，设计特异性引物，优化试验条件建立肉制品中猪、牛、羊源性成分的LAMP检测方法，旨在为肉类掺假鉴别提供方法依据及技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、兔肉、狗肉、驴肉、鹅肉、鹿肉、鱼肉、狐狸肉、貂肉、鼠肉、虾肉、马血；马血由甘肃省食品检验研究院提供。
1.2 主要仪器与试剂
实时荧光PCR仪（QuantStudio7荧光定量PCR仪），超微量分光光度计（eppendorf Biospectrometer basic 系列），通用性LAMP试剂盒（广州双螺旋基因有限公司），血液组织DNA提取试剂盒（Qiagen）。
1.3 DNA提取
试验样品DNA提取采用试剂盒（QIAGEN），提取DNA的浓度及纯度用超微量分光光度计测定。
1.4 引物设计
从GenBank数据库中检索获得猪、牛、羊物种ND1、COXⅠ、cytB特异性基因，利用BLAST在线比对软件进行分析，采用LAMP专用引物设计软件Primer Explorer Version 4设计LAMP引物，由大连宝生物有限公司合成，引物序列见表1。 1.5 LAMP反應体系
LAMP反应体系均设为25 μL，内引物、环引物与外引物比例为8∶4∶1，其中内引物终浓度为1.6 μmol/L，环引物终浓度为0.8 μmol/L，外引物终浓度为0.2 μmol/L，并在体系中加入12.5 μL 2×LAMP反应预混液、适量的Bst DNA 聚合酶及DNA模板。将混匀的反应体系置入荧光定量PCR仪中于63 ℃恒温反应40 min。
1.6 LAMP引物特异性分析
为了验证所选引物的特异性，分别使用猪、牛、羊的LAMP引物对猪肉、牛肉、羊肉，鸡肉、鸭肉、兔肉、狗肉、驴肉、鹅肉、鹿肉、鱼肉、狐狸肉、貂肉、鼠肉、虾肉、马肉样品的DNA进行LAMP反应，判断LAMP引物的针对目标物种的特异性。
1.7 LAMP引物灵敏度检测试验
将10倍梯度稀释的猪、牛、羊源性成分基因组DNA（10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg）分别用于LAMP方法检测样品核酸的灵敏度。
1.8 肉制品中目标成分含量测定
为了确定所建立的方法对模拟掺假肉样品的最低检出限，分别把鸭、马、肉3个物种掺入牛肉中，制备成不同掺假比例（10%、1%、0.1%、0.01%）的模拟混合肉样品，确定掺假肉制品中的最低检出浓度。
2 结果与分析
2.1 特异性试验
用设计的3种动物源性成分引物对16种动物的总DNA进行LAMP反应，其扩增结果见图1，仅针对猪、牛、羊3种动物源性成分产生了扩增曲线，其他混入的动物成分均未出现扩增曲线，表明该试验设计的LAMP引物具有较好的特异性。
2.2 灵敏度试验
将10倍梯度稀释的猪、牛和羊源性成分基因组DNA（10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg）分别用于LAMP反应，其扩增结果见图2，猪、羊源性成分的检测灵敏度可达10 pg DNA，牛源性成分的检测灵敏度为1 pg DNA。
2.3 模拟混合肉中目标成分含量测定
人工制备10%、1%、0.1%和 0.01%掺假比例的模拟样品，用上述设计的LAMP引物进行检测，结果如图3所示，猪、牛、羊源性成分检测均能检出0.01%的掺假样品，而阴性及空白对照反应管扩增呈现阴性。
3 讨论与结论
环介导等温扩增技术主要是根据特异性靶序列设计3对特异性引物，分别是外引物（F3/B3）、内引物（FIP/BIP）、环引物（FLP 和 BLP），其中环引物的加入使得扩增速度明显提高。该技术所需设备简单，不需要重复的降温升温的循环过程，具有操作简便、快速特异的优点。自从2000年LAMP技术发明以来，经过近20年的时间，LAMP技术从医学领域逐渐延伸到食品、农学等更多的领域，在很多领域都建立了一些检测方法，食品领域主要集中在食品掺杂掺假[4-6]、转基因[7-10]、过敏原[11]等领域。
基于核酸水平的动物源性成分检测比较关键的一点是选择合适的靶基因，核染色体基因、线粒体基因以及重复基因序列是常用的靶基因，这其中用的最多的是线粒体基因，首先线粒体基因拷贝数多，在食品加工过程中遭受的降解程度低[12-13]，其次在不同物种间具有特异性[14]。环介导等温扩增技术作为近几年新兴的一项技术有很多优点，但是由于在一个片段内需要同时设计6个引物，对于引物设计的要求较高，同时需要避免多条引物之间引物二聚体的形成及不同物种间的交叉反应，同时由于敏感性较高，在操作过程中尽量避免气溶胶污染，产生假阳性，操作过程尽量不要开盖。
该研究选取线粒体ND1、COXⅠ、cytB基因，经DNA软件比对选取的序列具有种间特异性，可用于区分不同物种动物。
该研究建立的猪、牛和羊源性成分的实时荧光LAMP检测方法具有较高的特异性，仅对含有目标DNA的样品有扩增，对其他动物源性成分的DNA没有交叉反应。实时荧光 LAMP 法对猪、羊源性成分的检测灵敏度均可达10 pg，牛源性成分的检测灵敏度可达1 pg。对模拟掺杂肉检测时，实时荧光LAMP法对掺杂猪肉、牛肉和羊肉的检测灵敏度可达0.01%。
参考文献
[1] 高宏伟，林超，王小敏，等.食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第8部分：猪成分检测 实时荧光PCR法：SN/T 3730.8—2013[S].北京：中国标准出版社，2014.
[2] 宗卉，卢体康，曹琛福，等.食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第5部分：马成分检测 实时荧光PCR法：SN/T 3730.5—2013[S].北京：中国标准出版社，2014.
[3] 宋涛平，杨丽霞，邱华丽，等.动物源性成分实时等温扩增检测方法的建立[J].食品安全质量检测学报，2017，8（8）：3207-3212.
[4] CHO A R，DONG H J，CHO S.Meat species identification using loopmediated isothermal amplification assay targeting speciesspecific mitochondrial DNA[J].Korean journal for food science of animal resources，2014，34（6）：799-807.
[5] DEB R，SENGAR G S，SINGH U，et al.Application of a loopmediated isothermal amplification assay for rapid detection of cow components adulterated in buffalo milk/meat[J].Molecular biotechnology，2016，58（12）：850-860. [6] ZAHRADNIK C，MARTZY R，MACH R L，et al.Loopmediated isothermal amplification（LAMP）for the detection of horse meat in meat and processed meat products[J].Food analytical methods，2015，8（6）：1576-1581.
[7] SINGH M，RANDHAWA G J，SOOD P，et al.Loopmediated isothermal amplification targeting insect resistant and herbicide tolerant transgenes：Monitoring for GM contamination in supply chain[J].Food control，2015，51：283-292.
[8] SINGH M，BHOGE R K，RANDHAWA G.Realtime and visual loopmediated isothermal amplification：Efficient GMO screening targeting pat and pmi marker genes[J].Food control，2017，71：248-254.
[9] 曾静，马丹，张蕾，等.出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第10部分：玉米MON88017品系：SN/T 3767.10—2014[S].北京：中国标准出版社，2014.
[10]贺艳，刘伟，赵卫东，等.出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第24部分：水稻LLrice62品系：SN/T 3767.24—2014[S].北京：中国标准出版社，2014.
[11] CHENG J X，ZHOU X C，DAN M A，et al.Establishment of a loopmediated isothermal amplification method for detection of mustard allergen in foods[J].Food science，2014，35（20）：148-152.
[12] BALLIN N Z，VOGENSEN F K，KARLSSON A H.Species determinationCan we detect and quantify meat adulteration？[J].Meat science，2009，83（2）：165-174.
[13] 唐修君，樊艷凤，贾晓旭，等.荧光PCR法检测畜禽肉中的鸡源性成分[J].现代食品科技，2018，34（7）：230-234.
[14] KUMAR Y，BANSAL S，JAISWAL P.Loopmediated isothermal amplification（LAMP）：A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products[J].Comprehensive reviews in food science and food safety，2017，16（6）：1359-1378.
关键词 猪源性成分；牛源性成分；羊源性成分；环介导等温扩增；可视化检测
中图分类号 TS207.3 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）09-0186-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.054
Abstract [Objective] The research aimed to establish a loopmediated isothermal amplification （ LAMP） method for porcin， bovine and sheepderived materials in meat products. [Method]LAMP primers were designed for ND1， COXI and cytB specific genes of pig， cattle and sheep， and the reaction results were judged by realtime detection of fluorescence intensity.[Result]The analytical sensitivity of the LAMP assay for porcin and sheep DNA were 10 pg，1 pg for bovine DNA. The detection limits for adulterated meat products could reach 0.01% for porcin， bovine and sheep.[Conclusion]This method exhibits a very high specificity and sensitivity for porcin， bovine，and sheepderived ingredients and can be used in filed studies ，and does not require any gelelectrophoresis apparatus.
Key words Porcinderived component；Bovinederived component；Sheepderived component；Loopmediated isothermal amplification；Visual detection
2013年的马肉风波在瑞典、德国、法国的部分牛肉中都发现掺杂马肉，国内媒体也多次曝光鸭肉冒充牛羊肉、假肉丸鱼丸等肉类食品掺假事件，肉类食品掺假问题是目前国际国内都比较关注的一个问题，美国《FDA食品安全现代化法案》已将掺假行为列入需要重点防范的食品安全风险之一，为了维护消费者权益，很多国家都对肉类产品含量标示做了明确要求，比如欧盟、美国都要求肉制品需标识所有成分及净含量，我国食品安全法也规定预包装食品包装上应标明名称、净含量、成分配料表等。
肉类掺假是目前研究的一个热点问题，各种检测方法的开发也应运而生，主流的检测方法主要是基于蛋白质和核酸而开发的方法，基于蛋白检测的方法有诸多的局限性，尤其是在深加工食品领域，蛋白在食品加工过程中结构发生了变化，变得不容易被识别，而以核酸为基础的方法就可以避免这些缺点，因为核酸在所有的生物组织基本都存在，在加工过的食品中不容易被降解，仍然可以被检测到，所以以核酸检测为基础的方法应用更为广泛。
目前国家也制定了一些肉类成分鉴定的标准[1-2]，这些标准都是通过DNA的检测技术来制定的，主要采用荧光定量和普通PCR的方法，常需要昂贵的仪器、专业的操作人员。环介导等温扩增技术是2000年日本学者发明的一种新技术，此技术自出现以来在细菌、病毒、转基因等领域得到了广泛的应用[3]，也有很多成型的商品试剂盒，比较适合应用到基层的实验室当中。
笔者根据猪、牛、羊物种ND1、COXⅠ、cytB特异性基因序列，设计特异性引物，优化试验条件建立肉制品中猪、牛、羊源性成分的LAMP检测方法，旨在为肉类掺假鉴别提供方法依据及技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、兔肉、狗肉、驴肉、鹅肉、鹿肉、鱼肉、狐狸肉、貂肉、鼠肉、虾肉、马血；马血由甘肃省食品检验研究院提供。
1.2 主要仪器与试剂
实时荧光PCR仪（QuantStudio7荧光定量PCR仪），超微量分光光度计（eppendorf Biospectrometer basic 系列），通用性LAMP试剂盒（广州双螺旋基因有限公司），血液组织DNA提取试剂盒（Qiagen）。
1.3 DNA提取
试验样品DNA提取采用试剂盒（QIAGEN），提取DNA的浓度及纯度用超微量分光光度计测定。
1.4 引物设计
从GenBank数据库中检索获得猪、牛、羊物种ND1、COXⅠ、cytB特异性基因，利用BLAST在线比对软件进行分析，采用LAMP专用引物设计软件Primer Explorer Version 4设计LAMP引物，由大连宝生物有限公司合成，引物序列见表1。 1.5 LAMP反應体系
LAMP反应体系均设为25 μL，内引物、环引物与外引物比例为8∶4∶1，其中内引物终浓度为1.6 μmol/L，环引物终浓度为0.8 μmol/L，外引物终浓度为0.2 μmol/L，并在体系中加入12.5 μL 2×LAMP反应预混液、适量的Bst DNA 聚合酶及DNA模板。将混匀的反应体系置入荧光定量PCR仪中于63 ℃恒温反应40 min。
1.6 LAMP引物特异性分析
为了验证所选引物的特异性，分别使用猪、牛、羊的LAMP引物对猪肉、牛肉、羊肉，鸡肉、鸭肉、兔肉、狗肉、驴肉、鹅肉、鹿肉、鱼肉、狐狸肉、貂肉、鼠肉、虾肉、马肉样品的DNA进行LAMP反应，判断LAMP引物的针对目标物种的特异性。
1.7 LAMP引物灵敏度检测试验
将10倍梯度稀释的猪、牛、羊源性成分基因组DNA（10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg）分别用于LAMP方法检测样品核酸的灵敏度。
1.8 肉制品中目标成分含量测定
为了确定所建立的方法对模拟掺假肉样品的最低检出限，分别把鸭、马、肉3个物种掺入牛肉中，制备成不同掺假比例（10%、1%、0.1%、0.01%）的模拟混合肉样品，确定掺假肉制品中的最低检出浓度。
2 结果与分析
2.1 特异性试验
用设计的3种动物源性成分引物对16种动物的总DNA进行LAMP反应，其扩增结果见图1，仅针对猪、牛、羊3种动物源性成分产生了扩增曲线，其他混入的动物成分均未出现扩增曲线，表明该试验设计的LAMP引物具有较好的特异性。
2.2 灵敏度试验
将10倍梯度稀释的猪、牛和羊源性成分基因组DNA（10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg）分别用于LAMP反应，其扩增结果见图2，猪、羊源性成分的检测灵敏度可达10 pg DNA，牛源性成分的检测灵敏度为1 pg DNA。
2.3 模拟混合肉中目标成分含量测定
人工制备10%、1%、0.1%和 0.01%掺假比例的模拟样品，用上述设计的LAMP引物进行检测，结果如图3所示，猪、牛、羊源性成分检测均能检出0.01%的掺假样品，而阴性及空白对照反应管扩增呈现阴性。
3 讨论与结论
环介导等温扩增技术主要是根据特异性靶序列设计3对特异性引物，分别是外引物（F3/B3）、内引物（FIP/BIP）、环引物（FLP 和 BLP），其中环引物的加入使得扩增速度明显提高。该技术所需设备简单，不需要重复的降温升温的循环过程，具有操作简便、快速特异的优点。自从2000年LAMP技术发明以来，经过近20年的时间，LAMP技术从医学领域逐渐延伸到食品、农学等更多的领域，在很多领域都建立了一些检测方法，食品领域主要集中在食品掺杂掺假[4-6]、转基因[7-10]、过敏原[11]等领域。
基于核酸水平的动物源性成分检测比较关键的一点是选择合适的靶基因，核染色体基因、线粒体基因以及重复基因序列是常用的靶基因，这其中用的最多的是线粒体基因，首先线粒体基因拷贝数多，在食品加工过程中遭受的降解程度低[12-13]，其次在不同物种间具有特异性[14]。环介导等温扩增技术作为近几年新兴的一项技术有很多优点，但是由于在一个片段内需要同时设计6个引物，对于引物设计的要求较高，同时需要避免多条引物之间引物二聚体的形成及不同物种间的交叉反应，同时由于敏感性较高，在操作过程中尽量避免气溶胶污染，产生假阳性，操作过程尽量不要开盖。
该研究选取线粒体ND1、COXⅠ、cytB基因，经DNA软件比对选取的序列具有种间特异性，可用于区分不同物种动物。
该研究建立的猪、牛和羊源性成分的实时荧光LAMP检测方法具有较高的特异性，仅对含有目标DNA的样品有扩增，对其他动物源性成分的DNA没有交叉反应。实时荧光 LAMP 法对猪、羊源性成分的检测灵敏度均可达10 pg，牛源性成分的检测灵敏度可达1 pg。对模拟掺杂肉检测时，实时荧光LAMP法对掺杂猪肉、牛肉和羊肉的检测灵敏度可达0.01%。
参考文献
[1] 高宏伟，林超，王小敏，等.食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第8部分：猪成分检测 实时荧光PCR法：SN/T 3730.8—2013[S].北京：中国标准出版社，2014.
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[8] SINGH M，BHOGE R K，RANDHAWA G.Realtime and visual loopmediated isothermal amplification：Efficient GMO screening targeting pat and pmi marker genes[J].Food control，2017，71：248-254.
[9] 曾静，马丹，张蕾，等.出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第10部分：玉米MON88017品系：SN/T 3767.10—2014[S].北京：中国标准出版社，2014.
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