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摘要：采用随机扩增多态性DNA（RAPD）标记对19份国内外苜蓿种质的遗传多样性进行分析。结果显示，7对RAPD引物在供试苜蓿材料中共获得有效扩增位点51个，其中多态性位点50个，多态性位点百分率为98.04%。引物的有效等位基因数、Neis基因多样性指数、Shannons信息指数和多态性信息含量平均分别为1.48个、0.29、0.44和0.33。供试苜蓿材料间的遗传相似系数介于0.039～0.922之间，平均为0.494。聚类分析和主成分分析均表明，供试苜蓿种质可被划分为两大类，其中第一类群包括的苜蓿种质数最多，达到16个，占所有供试苜蓿种质数的84.21%。研究结果将为供试苜蓿种质有效利用提供一定科学依据。
关键词：苜蓿；遗传多样性；RAPD分析
中图分类号： S551 .703文献标志码： A[HK]
文章编号：1002-1302（2017）13-0035-03[HS）][HT9.SS]
收稿日期：2016-03-15
基金项目：河南省科技攻关项目（编号：KJT142102110171）；河南省平顶山市科技计划（编号：2014086）。
作者简介：王健胜（1978—），男，陕西礼泉人，博士，讲师，主要从事作物遗传育种研究。E-mail：wjsheng1998@163.com。
[ZK）]
紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是多年生同源四倍体（2n=4x=32）和异花授粉植物，也是世界上最重要的豆科牧草之一，被誉为“牧草之王”[1]。紫花苜蓿在我国的栽培历史较长，其栽培面积也是牧草中最大的。近年来，随着人们对苜蓿产业发展的逐步重视，我国不断加强了国外苜蓿引种和种质资源交流，这为我国苜蓿相关研究提供了较为丰富的种质资源。但是，引种和品种资源交流频率的增加造成了现有苜蓿品种在名称和来源上的混乱，品种及种质的产权问题、种子质量问题也越来越严重，而且至今未能建立起有效的鉴别方法和标准，这也在一定程度上限制了优良种质资源的进一步开发利用。因此，开展苜蓿种质资源研究显得尤其重要。
分子标记技术作为重要研究手段在植物种质资源研究中得到了极为广泛的应用，但与其他主要农作物相比，利用分子标记开展苜蓿种质资源的研究仍较少。由于苜蓿分子标记研究起步较晚，导致苜蓿专有分子标记开发数量较少，因此现有苜蓿研究中利用的分子标记主要以随机标记为主。目前，包括扩增片段长度多态性（AFLP）[2]、微卫星（SSR）[3-4]、微卫星间隔（ISSR）[5-6]等多种类型分子标记都较好地被应用于苜蓿种质资源研究中。随机扩增多态性DNA（RAPD）标记是一种较早开发的分子标记技术，由于它具有易扩增、多态性高、操作简便、无种属限制等优点而被广泛应用于苜蓿遗传多样性研究中[7-9]。因此，本研究采用RAPD分子标记技术对国内外的19份苜蓿栽培种质进行了遗传多样性分析，在初步掌握不同苜蓿种质间亲缘关系的同时， 发现具有优良变异的苜蓿种质，为我国苜蓿种质的科学鉴定、保护和高效利用提供一定的基础。
1材料与方法
[HTK]1.1试验材料[HT]
供试材料基本信息见表1。
1.2DNA提取
每份材料随机选取10～15个单株幼嫩叶片等量混合，采用改良的十二烷基硫酸钠（SDS）法[10]混合提取基因组总DNA，经紫外分光光度计测定浓度后，稀释至适合浓度用于苜蓿基因组PCR扩增检测。
1.3RAPD标记检测
PCR扩增反应在Eppendorf PCR扩增仪上完成。PCR反应总体积为20 μL，包括1.5 μL基因组DNA（40 ng），1.5 μL引物（20 mmol/L），2.0 μL10×PCR缓冲液（含Mg2 ），2.0 μL 底物dNTPs（2.5 mmol/L），1.0 μL Taq酶（2 U/μL）和12 μL ddH2O。本研究用的RAPD引物相关信息见表2。
RAPD-PCR扩增程序：3个循环（94 ℃ 1 min，37 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min）；37个循环（94 ℃ 30 s，37 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min）； 最后72 ℃ 5 min。 扩增产物用浓度为 1.8% 的琼脂糖凝胶进行电泳检测，并在紫外凝胶成像系统上保存分析，同时为了保证试验的准确性，每个RAPD反应都需要重复3次以上。
1.4数据统计及分析
以0、1、9统计SCOT扩增带型，在相同迁移率位置上，有带记为“1”，无带记为“0”，缺失记为“9”，并建立分子数据矩阵。利用NTSYS-pc2.10软件通过非加权平均法（UPMGA）计算苜蓿种质间的遗传相似系数，并在此基础上作聚类分析及主要成分分析。采用POPGEN32软件估算SCOT标记的主要遗传多样性参数，包括引物扩增总条带数（TNB）、多态性条带数（NPB）、多态性条带百分率（PPB）、有效等位基因数（Ne）、Neis基因多样性指数（H）、Shannons信息指数（I）和多态性信息含量（PIC）。
2结果与分析
2.1苜蓿种质RAPD多态性分析
利用筛选出的多态性表现较好的7个RAPD引物对苜蓿种质群体进行了检测分析。由表3可见，不同RAPD引物对苜蓿基因组的扩增存在较大差异，单个RAPD引物扩增条带数分布在3～12个，平均为7.29个，多态性条带数分布在 2～12个，平均为5.14个。在所利用的RAPD引物中，除OPA13外，其余引物的多态性条带百分率均为100.00%，所有引物多态性条带百分率平均达到了95.24%。不同标记间的遗传参数差异也较大。有效等位基因数分布在1.32～167個，平均为1.48个；Neis基因多样性指数的分布范围是0.23～0.38，平均为 0.29；所有引物的Shannons信息指数都较高，其分布范围在0.38～0.55，平均为0.44。多态性信息含量是衡量分子标记有效性的重要指标之一，从表3不难看出，不同RAPD标记的多态性信息含量差异较大，其分布范围在0.23～0.41，平均为0.33。
关键词：苜蓿；遗传多样性；RAPD分析
中图分类号： S551 .703文献标志码： A[HK]
文章编号：1002-1302（2017）13-0035-03[HS）][HT9.SS]
收稿日期：2016-03-15
基金项目：河南省科技攻关项目（编号：KJT142102110171）；河南省平顶山市科技计划（编号：2014086）。
作者简介：王健胜（1978—），男，陕西礼泉人，博士，讲师，主要从事作物遗传育种研究。E-mail：wjsheng1998@163.com。
[ZK）]
紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是多年生同源四倍体（2n=4x=32）和异花授粉植物，也是世界上最重要的豆科牧草之一，被誉为“牧草之王”[1]。紫花苜蓿在我国的栽培历史较长，其栽培面积也是牧草中最大的。近年来，随着人们对苜蓿产业发展的逐步重视，我国不断加强了国外苜蓿引种和种质资源交流，这为我国苜蓿相关研究提供了较为丰富的种质资源。但是，引种和品种资源交流频率的增加造成了现有苜蓿品种在名称和来源上的混乱，品种及种质的产权问题、种子质量问题也越来越严重，而且至今未能建立起有效的鉴别方法和标准，这也在一定程度上限制了优良种质资源的进一步开发利用。因此，开展苜蓿种质资源研究显得尤其重要。
分子标记技术作为重要研究手段在植物种质资源研究中得到了极为广泛的应用，但与其他主要农作物相比，利用分子标记开展苜蓿种质资源的研究仍较少。由于苜蓿分子标记研究起步较晚，导致苜蓿专有分子标记开发数量较少，因此现有苜蓿研究中利用的分子标记主要以随机标记为主。目前，包括扩增片段长度多态性（AFLP）[2]、微卫星（SSR）[3-4]、微卫星间隔（ISSR）[5-6]等多种类型分子标记都较好地被应用于苜蓿种质资源研究中。随机扩增多态性DNA（RAPD）标记是一种较早开发的分子标记技术，由于它具有易扩增、多态性高、操作简便、无种属限制等优点而被广泛应用于苜蓿遗传多样性研究中[7-9]。因此，本研究采用RAPD分子标记技术对国内外的19份苜蓿栽培种质进行了遗传多样性分析，在初步掌握不同苜蓿种质间亲缘关系的同时， 发现具有优良变异的苜蓿种质，为我国苜蓿种质的科学鉴定、保护和高效利用提供一定的基础。
1材料与方法
[HTK]1.1试验材料[HT]
供试材料基本信息见表1。
1.2DNA提取
每份材料随机选取10～15个单株幼嫩叶片等量混合，采用改良的十二烷基硫酸钠（SDS）法[10]混合提取基因组总DNA，经紫外分光光度计测定浓度后，稀释至适合浓度用于苜蓿基因组PCR扩增检测。
1.3RAPD标记检测
PCR扩增反应在Eppendorf PCR扩增仪上完成。PCR反应总体积为20 μL，包括1.5 μL基因组DNA（40 ng），1.5 μL引物（20 mmol/L），2.0 μL10×PCR缓冲液（含Mg2 ），2.0 μL 底物dNTPs（2.5 mmol/L），1.0 μL Taq酶（2 U/μL）和12 μL ddH2O。本研究用的RAPD引物相关信息见表2。
RAPD-PCR扩增程序：3个循环（94 ℃ 1 min，37 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min）；37个循环（94 ℃ 30 s，37 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min）； 最后72 ℃ 5 min。 扩增产物用浓度为 1.8% 的琼脂糖凝胶进行电泳检测，并在紫外凝胶成像系统上保存分析，同时为了保证试验的准确性，每个RAPD反应都需要重复3次以上。
1.4数据统计及分析
以0、1、9统计SCOT扩增带型，在相同迁移率位置上，有带记为“1”，无带记为“0”，缺失记为“9”，并建立分子数据矩阵。利用NTSYS-pc2.10软件通过非加权平均法（UPMGA）计算苜蓿种质间的遗传相似系数，并在此基础上作聚类分析及主要成分分析。采用POPGEN32软件估算SCOT标记的主要遗传多样性参数，包括引物扩增总条带数（TNB）、多态性条带数（NPB）、多态性条带百分率（PPB）、有效等位基因数（Ne）、Neis基因多样性指数（H）、Shannons信息指数（I）和多态性信息含量（PIC）。
2结果与分析
2.1苜蓿种质RAPD多态性分析
利用筛选出的多态性表现较好的7个RAPD引物对苜蓿种质群体进行了检测分析。由表3可见，不同RAPD引物对苜蓿基因组的扩增存在较大差异，单个RAPD引物扩增条带数分布在3～12个，平均为7.29个，多态性条带数分布在 2～12个，平均为5.14个。在所利用的RAPD引物中，除OPA13外，其余引物的多态性条带百分率均为100.00%，所有引物多态性条带百分率平均达到了95.24%。不同标记间的遗传参数差异也较大。有效等位基因数分布在1.32～167個，平均为1.48个；Neis基因多样性指数的分布范围是0.23～0.38，平均为 0.29；所有引物的Shannons信息指数都较高，其分布范围在0.38～0.55，平均为0.44。多态性信息含量是衡量分子标记有效性的重要指标之一，从表3不难看出，不同RAPD标记的多态性信息含量差异较大，其分布范围在0.23～0.41，平均为0.33。