论文部分内容阅读
摘 要 目的：研究泊洛沙姆188复验期后放置时间对其品质和细胞培养的影响，为泊洛沙姆188复验期的确定提供依据。方法：分别对复验期后6个月、24个月和36个月的泊洛沙姆188进行pH、内毒素含量测定、拉曼鉴别和细胞培养测试，评估其作为培养基组分对细胞生长和重组蛋白表达的影响。结果：泊洛沙姆188在复验期后36个月以内的pH、内毒素含量和拉曼鉴别符合标准，使用复验期后24个月以内的泊洛沙姆188对细胞生长、活率和表达量与复验期内的无显著差异，但使用复验期后36个月的泊洛沙姆188细胞生长和活率及重组蛋白表达量均降低。结论：泊洛沙姆188用于无血清培养基组分时，复验期建议为24个月。
关键词 泊洛沙姆188 细胞培养 无血清培养基 复验
中图分类号：TQ460.4 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2021）13-0077-04
Study on retest period of poloxamer 188
ZHANG Cunchao， HU Xiaoyu， REN Pengcheng
（Shanghai Sinomab Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）
ABSTRACT Objective： To study the effect of Poloxamer 188 after the retest period on its quality and cell culture. Methods： The determination of pH， endotoxin content and cell culture and the identification of Raman spectra to poloxamer 188 at 6， 24 and 36 months after the retest period were performed to evaluate its effects on cell growth and recombinant protein expression as a medium component. Results： The pH， endotoxin content and Raman identification of poloxamer 188 within 36 months after the retest period met the related standards. Poloxamer 188 within 24 months after retest date showed no differences in cell growth and viability and the protein expression compared with one within retest date， however， those indicators were all decreased when poloxamer 188 stored for 36 months after retest date was used. Conclusion： The retest period of poloxamer 188 is suggested to be 24 months after retest date as a component for serum free medium.
KEy WORDS poloxamer 188； cell culture test； serum free medium； retest
無血清培养基是重组蛋白生产中的关键原材料，是影响重组蛋白产量和产品质量的重要因素。泊洛沙姆188属聚氧乙烯和聚氧丙烯的聚合物，是一种无血清培养基中常用的原料，用于培养时减轻生物反应器中搅拌对细胞剪切的损伤，通常在常温条件下保存[1-2]。
目前，对培养基的原料管理尚未有明确的标准。一方面，可参考药用原辅料进行管理；另外一方面，培养基有其特殊性，原辅料的检验指标并不能指示原料是否对无血清培养基使用效果造成影响。
物料保存时间一般以有效期或复验期表示，一般认为有效期后不可再进行检验，而复验期后可根据检验结果确定是否可继续使用，有效期和复验期的确定一般基于其稳定性数据。本研究对其复验期进行检查，以确定其作为无血清培养基组分使用时的复验指标及复验期，建立适合无血清培养基生产使用的标准。
1 材料与方法
1.1 材料
泊洛沙姆188购自巴斯夫中国有限公司，批号分别为GNC11021B（复验期2021-04-19）、WPmL511D（复验期2019-09-17，超过复验期6个月）、WPAK527B（复验期2018-03-08，超过复验期24个月）、WPYJ536B（复验期2017-02-08，超过复验期36个月），保存条件均为常温；无水葡萄糖（批号201812303）购自山东西王药业有限公司，保存条件为常温；#1-16无血清培养基（自制培养基，不含泊洛沙姆188）；CHOM-S03无血清培养基（批号20180903）和CHOM-S04无血清培养基培养基（批号20180904）由上海迈泰君奥生物技术有限公司提供，保存在2～8 ℃；葡萄糖测定试剂盒（批号90142002-2）购自上海卓茵医疗仪器有限公司，保存在2～8 ℃；鲎试剂购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司；其他化学试剂均为市售分析纯。
1379型生物安全柜和ST16R台式离心机（美国Thermo公司）；Multitron Pro振荡培养箱（瑞士Infors公司）；Vi-cell XR细胞活力分析仪（美国贝克曼-库尔特公司，所用试剂包为上海迈泰君奥生物技术有限公司自研试剂包）；Acquity液相色谱（美国Waters公司）；FE28 pH计、ME802电子天平、ReactRaman 785拉曼光谱仪（瑞士梅特勒-托勒多公司）；Absolute A Column（2.0 mm×30 mm，填料粒径30 mm，加莱克公司）；Steritop Quick Release-GP一次性杯式滤器（滤膜孔径0.22 mm，美国Merck公司）。 1.2 方法
参考《中国药典》有关规定对泊洛沙姆188进行pH和细菌内毒素测定及拉曼光谱鉴别[3]。
1）基础培养基 称量#1-16无血清培养基干粉22.7 g四份至四个烧杯中，分别添加氢氧化钠2.5 g和纯化水800 mL后搅拌1 h，然后添加稀盐酸调节pH至（7.2±0.1），搅拌1 h。添加碳酸氢钠2 g，搅拌30 min，用纯化水定容至1 L。将不同批号的泊洛沙姆188按1.0 g/L分别加入#1-16中。搅拌30 min后，使用一次性杯式滤器过滤除菌。
2）中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养 使用RCB-12（表达一种重组单克隆抗体）作为种子细胞，于2～8℃、800×g 离心5 min，离心换液后，取细胞沉淀重悬至上述添加不同泊洛沙姆188的#1-16培养基中，在振荡培养箱中进行培养（转速为120 r/min，37 ℃，二氧化碳体积分数为5%）。培养基添加量为50 mL；初始接种密度0.8×106个细胞/mL。从培养第2天开始，每天添加1.5% CHOM-S03和0.15% CHOM-S04补料培养基。添加复验期内泊洛沙姆188的为对照组，添加其余3批过复验期的泊洛沙姆188的为实验组。本研究中各实验条件各设置3个重复样品。对照组和实验组同时进行培养。培养期间，每天使用细胞活力分析仪进行细胞计数、按葡萄糖测定试剂盒说明书测定葡萄糖浓度，并补加葡萄糖至浓度为3.0 g/L。
3）表达量测定 培养至第12天结束，各摇瓶取样 1.0 mL，按文献测定表达量[4]。取样用800×g 离心10 min后，取上清液用加莱克Absolute A Column進行亲和层析纯化。收集滤过液，在波长280 nm处测定吸光度。
2 结果
2.1 泊洛沙姆188检测结果
结果显示，复验期内及复验期后6～36个月的泊洛沙姆188在拉曼光谱鉴别、pH和细菌内毒素方面均符合质量标准（表1）。
2.2 细胞培养
2.2.1 活细胞密度
对比培养前期活细胞密度变化可知，加入复验期后6、24个月的泊洛沙姆188活细胞密度与复验期内泊洛沙姆188无明显差异；加入复验期后36个月的泊洛沙姆188活细胞密度从第3天起低于其他实验组，且第6天最高活细胞密度比对照降低了21.4%。在培养后期（第8天后），随着补料培养基不断加入，基础培养基中不同复验期的泊洛沙姆188对细胞生长的影响基本消除（图1）。总之，复验期后6、24个月的泊洛沙姆188对细胞密度无显著影响，但复验期后36个月的泊洛沙姆188可显著降低活细胞密度。
2.2.2 细胞活率
加入复验期后不同时间的泊洛沙姆188与复验期内的相比，在细胞培养早期（0～5 d），活率无明显下降，而第6天开始活率逐渐降低；但与对照相比，细胞活率变化趋势一致，无明显差异（图2）。
2.2.3 重组蛋白表达量
与复验期内泊洛沙姆188相比，加入复验期后6和24个月的泊洛沙姆188，其重组蛋白表达量无显著差异，但加入复验期后36个月的泊洛沙姆188，其重组蛋白表达量比对照降低了18.0%（图3）。
3 讨论
药典中对泊洛沙姆188检测进行了规定，包括性状、鉴别和检查三方面，侧重于检查方面的要求，包括酸碱度、溶液的澄清度与颜色、氧乙烯、不饱和度、平均分子量及杂质等[3]。然而，泊洛沙姆188作为培养基成分添加到培养基中时，还需考虑对细胞生长等的影响，这是药典标准中所缺失的。本研究填补了药典在这方面的空缺。
本研究结果显示，泊洛沙姆188常温放置36个月后，导致细胞培养时活细胞密度降低，这可能在长期放置过程中发生了在拉曼光谱鉴别中难以反映出的降解，进而导致作为培养基组分时的细胞培养效果下降，这些降解产物或许可通过一些分析手段进行确定[6]。在溶液中，泊洛沙姆188的降解情况取决于温度、泊洛沙姆188浓度以及缓冲液的组成[7]。根据阿伦尼乌斯公式（Arrhenius equation，k=Ae（-Ea/RT））[8]，温度降低，反应速率也会降低。因此，泊洛沙姆188作为组分添加到培养基干粉后，其保存温度由常温降低至2～8 ℃，反应速率也会发生一定程度降低，而降低倍数需经实验确定。本公司对无血清培养基的稳定性研究（数据未公开）显示，无血清培养基干粉在2～8 ℃保存2年以上不影响产品质量，即泊洛沙姆188作为组分添加到无血清培养基干粉中保存2年以上，其稳定性不会有明显变化。
本研究中，添加复验期后36个月泊洛沙姆188时活细胞密度降低，其原因有待进一步验证。此外，泊洛沙姆188厂家推荐的保存条件为常温保存，而添加到无血清培养基中之后，作为干粉是2～8 ℃保存。本研究仅对其常温的稳定性进行了研究，然而作为一种组分添加到无血清培养基干粉后是低温保存的，后续研究需对低温放置的影响进行研究。
本研究是在摇瓶中进行，未直接考察泊洛沙姆188在生物反应器中的抗剪切作用。然而，使用摇瓶在摇床中培养时，摇床的震荡也是一种剪切力。在本研究中使用摇床的震荡代替生物反应器中的搅拌进行研究，可为后续在生物反应器中的进一步研究提供借鉴。
参考文献
[1] 谭文松， 戴干策， 陈志宏， 等. 搅拌生物反应器中杂交瘤细胞生长与破损的初步研究[J]. 生物工程学报， 1996， 12（S1）： 190-196.
[2] 吴刚， 赖润龙， 张填波. 泊洛沙姆188的研究进展[J]. 中国现代医生， 2008， 46（12）： 48-49.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2020年版四部[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2020： 699-700.
[4] Jing Y， Zhang C， Fu T， et al. Combination of dextran sulfate and recombinant trypsin on aggregation of Chinese hamster ovary cells[J]. Cytotechnology， 2016， 68（2）： 241-248.
[5] HG/T3935-2007哺乳类动物细胞培养基[EB/OL]. （2007-04-13）[2020-09-27]. http：//file4.foodmate.net/foodvip/ biaozhun/2017/zengbu/HGT3935-2007.pdf.
[6] 段梦茹， 何东升， 孙会敏， 等. 气相色谱法检测泊洛沙姆188中环氧化物杂质[J]. 药学研究， 2020， 39（6）： 331-335；340.
[7] Wang T， Markham A， Thomas SJ， et al. Solution stability of Poloxamer 188 under stress conditions[J]. J Pharm Sci， 2019， 108（3）： 1264-1271.
[8] Porterfield RI， Capone JJ. Application of kinetic models and Arrhenius methods to product stability evaluation[J]. Med Devices Diagn Ind， 1984， 6： 45-50.
关键词 泊洛沙姆188 细胞培养 无血清培养基 复验
中图分类号：TQ460.4 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2021）13-0077-04
Study on retest period of poloxamer 188
ZHANG Cunchao， HU Xiaoyu， REN Pengcheng
（Shanghai Sinomab Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）
ABSTRACT Objective： To study the effect of Poloxamer 188 after the retest period on its quality and cell culture. Methods： The determination of pH， endotoxin content and cell culture and the identification of Raman spectra to poloxamer 188 at 6， 24 and 36 months after the retest period were performed to evaluate its effects on cell growth and recombinant protein expression as a medium component. Results： The pH， endotoxin content and Raman identification of poloxamer 188 within 36 months after the retest period met the related standards. Poloxamer 188 within 24 months after retest date showed no differences in cell growth and viability and the protein expression compared with one within retest date， however， those indicators were all decreased when poloxamer 188 stored for 36 months after retest date was used. Conclusion： The retest period of poloxamer 188 is suggested to be 24 months after retest date as a component for serum free medium.
KEy WORDS poloxamer 188； cell culture test； serum free medium； retest
無血清培养基是重组蛋白生产中的关键原材料，是影响重组蛋白产量和产品质量的重要因素。泊洛沙姆188属聚氧乙烯和聚氧丙烯的聚合物，是一种无血清培养基中常用的原料，用于培养时减轻生物反应器中搅拌对细胞剪切的损伤，通常在常温条件下保存[1-2]。
目前，对培养基的原料管理尚未有明确的标准。一方面，可参考药用原辅料进行管理；另外一方面，培养基有其特殊性，原辅料的检验指标并不能指示原料是否对无血清培养基使用效果造成影响。
物料保存时间一般以有效期或复验期表示，一般认为有效期后不可再进行检验，而复验期后可根据检验结果确定是否可继续使用，有效期和复验期的确定一般基于其稳定性数据。本研究对其复验期进行检查，以确定其作为无血清培养基组分使用时的复验指标及复验期，建立适合无血清培养基生产使用的标准。
1 材料与方法
1.1 材料
泊洛沙姆188购自巴斯夫中国有限公司，批号分别为GNC11021B（复验期2021-04-19）、WPmL511D（复验期2019-09-17，超过复验期6个月）、WPAK527B（复验期2018-03-08，超过复验期24个月）、WPYJ536B（复验期2017-02-08，超过复验期36个月），保存条件均为常温；无水葡萄糖（批号201812303）购自山东西王药业有限公司，保存条件为常温；#1-16无血清培养基（自制培养基，不含泊洛沙姆188）；CHOM-S03无血清培养基（批号20180903）和CHOM-S04无血清培养基培养基（批号20180904）由上海迈泰君奥生物技术有限公司提供，保存在2～8 ℃；葡萄糖测定试剂盒（批号90142002-2）购自上海卓茵医疗仪器有限公司，保存在2～8 ℃；鲎试剂购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司；其他化学试剂均为市售分析纯。
1379型生物安全柜和ST16R台式离心机（美国Thermo公司）；Multitron Pro振荡培养箱（瑞士Infors公司）；Vi-cell XR细胞活力分析仪（美国贝克曼-库尔特公司，所用试剂包为上海迈泰君奥生物技术有限公司自研试剂包）；Acquity液相色谱（美国Waters公司）；FE28 pH计、ME802电子天平、ReactRaman 785拉曼光谱仪（瑞士梅特勒-托勒多公司）；Absolute A Column（2.0 mm×30 mm，填料粒径30 mm，加莱克公司）；Steritop Quick Release-GP一次性杯式滤器（滤膜孔径0.22 mm，美国Merck公司）。 1.2 方法
参考《中国药典》有关规定对泊洛沙姆188进行pH和细菌内毒素测定及拉曼光谱鉴别[3]。
1）基础培养基 称量#1-16无血清培养基干粉22.7 g四份至四个烧杯中，分别添加氢氧化钠2.5 g和纯化水800 mL后搅拌1 h，然后添加稀盐酸调节pH至（7.2±0.1），搅拌1 h。添加碳酸氢钠2 g，搅拌30 min，用纯化水定容至1 L。将不同批号的泊洛沙姆188按1.0 g/L分别加入#1-16中。搅拌30 min后，使用一次性杯式滤器过滤除菌。
2）中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养 使用RCB-12（表达一种重组单克隆抗体）作为种子细胞，于2～8℃、800×g 离心5 min，离心换液后，取细胞沉淀重悬至上述添加不同泊洛沙姆188的#1-16培养基中，在振荡培养箱中进行培养（转速为120 r/min，37 ℃，二氧化碳体积分数为5%）。培养基添加量为50 mL；初始接种密度0.8×106个细胞/mL。从培养第2天开始，每天添加1.5% CHOM-S03和0.15% CHOM-S04补料培养基。添加复验期内泊洛沙姆188的为对照组，添加其余3批过复验期的泊洛沙姆188的为实验组。本研究中各实验条件各设置3个重复样品。对照组和实验组同时进行培养。培养期间，每天使用细胞活力分析仪进行细胞计数、按葡萄糖测定试剂盒说明书测定葡萄糖浓度，并补加葡萄糖至浓度为3.0 g/L。
3）表达量测定 培养至第12天结束，各摇瓶取样 1.0 mL，按文献测定表达量[4]。取样用800×g 离心10 min后，取上清液用加莱克Absolute A Column進行亲和层析纯化。收集滤过液，在波长280 nm处测定吸光度。
2 结果
2.1 泊洛沙姆188检测结果
结果显示，复验期内及复验期后6～36个月的泊洛沙姆188在拉曼光谱鉴别、pH和细菌内毒素方面均符合质量标准（表1）。
2.2 细胞培养
2.2.1 活细胞密度
对比培养前期活细胞密度变化可知，加入复验期后6、24个月的泊洛沙姆188活细胞密度与复验期内泊洛沙姆188无明显差异；加入复验期后36个月的泊洛沙姆188活细胞密度从第3天起低于其他实验组，且第6天最高活细胞密度比对照降低了21.4%。在培养后期（第8天后），随着补料培养基不断加入，基础培养基中不同复验期的泊洛沙姆188对细胞生长的影响基本消除（图1）。总之，复验期后6、24个月的泊洛沙姆188对细胞密度无显著影响，但复验期后36个月的泊洛沙姆188可显著降低活细胞密度。
2.2.2 细胞活率
加入复验期后不同时间的泊洛沙姆188与复验期内的相比，在细胞培养早期（0～5 d），活率无明显下降，而第6天开始活率逐渐降低；但与对照相比，细胞活率变化趋势一致，无明显差异（图2）。
2.2.3 重组蛋白表达量
与复验期内泊洛沙姆188相比，加入复验期后6和24个月的泊洛沙姆188，其重组蛋白表达量无显著差异，但加入复验期后36个月的泊洛沙姆188，其重组蛋白表达量比对照降低了18.0%（图3）。
3 讨论
药典中对泊洛沙姆188检测进行了规定，包括性状、鉴别和检查三方面，侧重于检查方面的要求，包括酸碱度、溶液的澄清度与颜色、氧乙烯、不饱和度、平均分子量及杂质等[3]。然而，泊洛沙姆188作为培养基成分添加到培养基中时，还需考虑对细胞生长等的影响，这是药典标准中所缺失的。本研究填补了药典在这方面的空缺。
本研究结果显示，泊洛沙姆188常温放置36个月后，导致细胞培养时活细胞密度降低，这可能在长期放置过程中发生了在拉曼光谱鉴别中难以反映出的降解，进而导致作为培养基组分时的细胞培养效果下降，这些降解产物或许可通过一些分析手段进行确定[6]。在溶液中，泊洛沙姆188的降解情况取决于温度、泊洛沙姆188浓度以及缓冲液的组成[7]。根据阿伦尼乌斯公式（Arrhenius equation，k=Ae（-Ea/RT））[8]，温度降低，反应速率也会降低。因此，泊洛沙姆188作为组分添加到培养基干粉后，其保存温度由常温降低至2～8 ℃，反应速率也会发生一定程度降低，而降低倍数需经实验确定。本公司对无血清培养基的稳定性研究（数据未公开）显示，无血清培养基干粉在2～8 ℃保存2年以上不影响产品质量，即泊洛沙姆188作为组分添加到无血清培养基干粉中保存2年以上，其稳定性不会有明显变化。
本研究中，添加复验期后36个月泊洛沙姆188时活细胞密度降低，其原因有待进一步验证。此外，泊洛沙姆188厂家推荐的保存条件为常温保存，而添加到无血清培养基中之后，作为干粉是2～8 ℃保存。本研究仅对其常温的稳定性进行了研究，然而作为一种组分添加到无血清培养基干粉后是低温保存的，后续研究需对低温放置的影响进行研究。
本研究是在摇瓶中进行，未直接考察泊洛沙姆188在生物反应器中的抗剪切作用。然而，使用摇瓶在摇床中培养时，摇床的震荡也是一种剪切力。在本研究中使用摇床的震荡代替生物反应器中的搅拌进行研究，可为后续在生物反应器中的进一步研究提供借鉴。
参考文献
[1] 谭文松， 戴干策， 陈志宏， 等. 搅拌生物反应器中杂交瘤细胞生长与破损的初步研究[J]. 生物工程学报， 1996， 12（S1）： 190-196.
[2] 吴刚， 赖润龙， 张填波. 泊洛沙姆188的研究进展[J]. 中国现代医生， 2008， 46（12）： 48-49.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2020年版四部[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2020： 699-700.
[4] Jing Y， Zhang C， Fu T， et al. Combination of dextran sulfate and recombinant trypsin on aggregation of Chinese hamster ovary cells[J]. Cytotechnology， 2016， 68（2）： 241-248.
[5] HG/T3935-2007哺乳类动物细胞培养基[EB/OL]. （2007-04-13）[2020-09-27]. http：//file4.foodmate.net/foodvip/ biaozhun/2017/zengbu/HGT3935-2007.pdf.
[6] 段梦茹， 何东升， 孙会敏， 等. 气相色谱法检测泊洛沙姆188中环氧化物杂质[J]. 药学研究， 2020， 39（6）： 331-335；340.
[7] Wang T， Markham A， Thomas SJ， et al. Solution stability of Poloxamer 188 under stress conditions[J]. J Pharm Sci， 2019， 108（3）： 1264-1271.
[8] Porterfield RI， Capone JJ. Application of kinetic models and Arrhenius methods to product stability evaluation[J]. Med Devices Diagn Ind， 1984， 6： 45-50.