论文部分内容阅读
摘要：采用EST-SSR标记构建中国常熟尚湖牡丹园引栽的21个日本牡丹品种DNA指纹图谱并进行遗传多样性分析。以筛选出的10对多态性高、稳定性好且在染色体上分布均匀的引物作为核心引物，构建日本牡丹21个品种DNA指纹图谱，用NTSYS-PCV2.10软件分析遗传多样性。结果表明，10对EST-SSR引物在21份材料中共扩增出47个多态性基因型，平均每对引物扩增4.7个，变幅1～11个；10对引物的多态性频率（FP）平均值为0.522，变幅0227～0.950；筛选出的2对核心引物可以将21个牡丹品种完全区分，以遗传相似系数0.55为阈值可将21个供试牡丹品种分成2类。由结果可知，EST-SSR标记在供试牡丹品种间多态性差异较大，适合用于牡丹的DNA指纹图谱的构建。
关键词：EST-SSR；DNA指纹图谱；遗传多样性；牡丹品种
中图分类号： S685.11文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0050-04
收稿日期：2014-09-21
基金项目：江苏农业科技支撑计划（编号：BE2011445）；江苏省大学生实践创新训练计划（编号：201310333032Y）；江苏省苏州市科技计划（编号：SZS201102、SYN201110、SNG201323）；苏州市吴江区科技计划（编号：WN201311、WN201317）；江苏省常熟市科技计划（编号：CS201205）。
作者简介：孙嘉磊（1992—），男，江苏太仓人，研究方向为植物资源利用开发。
通信作者：杨志刚，硕士，副教授，从事天然产物研究与开发。Tel：（0512）52251562；E-mail：zhigangyang77@sina.cn。牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews.）花大色艳，花香袭人，有“国色天香”之美誉，深受人们喜爱。关于DNA指纹技术在牡丹品种鉴别上的应用，前人做了很多研究。朱红霞利用AFLP标记对牡丹品种的分类进行了初步探索[1]。Hosoki等利用RAPD标记技术对牡丹品种和野生牡丹品种的DNA序列进行了尝试性分析[2]。由于技术比较成熟，以微卫星序列为基础的SSR标记成为当前植物品种DNA指纹图谱数据库的首选标记[3]。李保印利用SSR标记技术研究中原牡丹品种初级核心种质和遗传多样性，并建立了核心种质[4]。王淼等研究讨论了牡丹品种的SSR-PCR反应条件[5]。SSR分子标记技术可以用来区分牡丹品种，这是不容争辩的事实[6]，近年来EST（expressed sequence tages）发展十分迅速，而EST-SSR与其他鉴别途径相比，是一种相对准确、简便、经济的途径[7]。Temnykh 等研究显示，他们所发现的牡丹EST-SSR位点绝大多数都具有多态性潜能[8]。张艳丽等以6个滇牡丹不同花色类群DNA为模板，对EST-SSR引物进行了筛选[9]。
牡丹品种的起源地在中国，在中国牡丹园艺栽培不断发展的同时，日本也早就开始进行牡丹园艺品种的杂交培育和引种工作，形成了具有地方特色的牡丹品种群[10]，而目前针对国内引栽的日本品系牡丹开展DNA指纹图谱构建及遗传多样性的研究还未见报道。本研究采用EST-SSR标记构建中国常熟尚湖牡丹园21份日本品系牡丹品种的DNA指纹图谱并进行遗传多样性分析，以期为牡丹品种DNA指纹鉴定提供技术支持。
1材料与方法
1.1供试材料
21份牡丹品种为中国常熟尚湖牡丹园引栽的日本牡丹品种，详见表1。
表1供试21份日本牡丹主栽品种概况
编号品种名称花色编号品种名称花色1岛锦复色12岛大臣紫2岛辉红13金晃黄3日暮红14海黄黄4百花选红15玉廉白5火鸟红16连鹤白6花王深银红17黑龙锦墨紫7芳纪火红18新扶桑白8新日月红19八千代椿银红9红辉狮子大红20吉野川粉10花竞粉21紫晃粉11皇嘉门黑紫
1.2DNA提取
按照CTAB法提取牡丹基因组DNA，操作流程如下：（1）在研钵中加入100 mg牡丹叶片样品和700 μL CTAB提取液，充分研磨；（2）转移混合液至1.5 mL离心管中，65 ℃水浴 30 min，每隔5 min振荡混匀；（3）取出离心管，冷却到室温后，于8 000 r/min离心2 min；（4）取出离心管，将上清液转移至1.5 mL离心管中，加入等体积三氯甲烷混匀，振荡10 min；（5）12 000 r/min常温离心10 min；（6）转移上清液至1.5 mL离心管中，加等体积异丙醇，混匀后静置10 min，于 12 000 r/min 离心10 min，弃上清液，用70%～75%乙醇漂洗沉淀2次，在超净工作台上吹干；（7）加50 μL ddH2O，将沉淀DNA溶解后于4 ℃冰箱保存备用。
1.3引物信息
以张艳丽等对滇牡丹不同花色类群开发的10对EST-SSR引物[9]作为本研究的候选引物（表2），引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化。
20 μL反应液中包括10×PCR buffer、0.1 mmol/L dNTP、1 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L Mg2 、50 ng DNA模版和 03 μmol/L EST-SSR引物。反应程序：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物选用60 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，36 W电泳3 h。参考王凤格等的快速银染法[11]并稍加修改：50%乙醇、2.5%冰乙酸组成的固定液固定5 min；双蒸水快速漂洗1次；0.2%AgNO3染色5 min；15% NaOH、0.4%甲醛组成的显影液显影；固定液定影。 1.5数据分析
根据EST-SSR扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，观察稳定且易于辨别的差异性条带，选出具有多态性的引物，记录并进行统计分析，建立其DNA指纹图谱。统计每对引物扩增的条带数，计算多态性频率（frequency of polymorphism，FP）。用Excel计算物种间相似系数（GS）和遗传距离指数（D），根据所得遗传系数矩阵用NTSYS2.1软件进行统计分析并作聚类分析图。
2结果与分析
2.1EST-SSR标记多态性分析
10对EST-SSR引物及相应产物片段信息见表2。用10对SSR标记引物在21份供试品牡丹中共检测到47个多态性基因型（表3），每对引物的基因型数不等，变幅为1～11个，平均4.7个，这些引物对所有供试材料的扩增结果重复性好、特异性高、条带清晰且多态性丰富（图1）。其中引物P10扩增的基因型最多，为11个；P1基因型最少，为1个，多态性最差。10对SSR引物的FP值平均为0.521，其中FP值最大为P1的0.950，其次是P6的0.607，最小为P8的0.277。各标记的多态性存在明显的差异，多态性位点多且FP值越高，表明相应标记对牡丹品种的鉴别能力越好，如P10。
表3EST-SSR引物扩增的信息
位点重复基元基因型数（个）FP值P1（CTC）410.950P2（GCA）470.523 P3（AAG）420.440 P4（TTAA）330.467P5（TCTCGC）370.538 P6（AGA）530.607 P7（CATTT）370.349 P8（ACTGA）340.277 P9（CAC）420.523P10（GGT）4110.542
2.2DNA指纹图谱分析
采用上述10对EST-SSR引物对21个品种进行指纹分析，挑选出多态性相对丰富的引物进行组合鉴别，选择P5、P10共2对核心引物进行组合就可将21份供试牡丹品种完全区分开（表4）。其中用P10扩增出的特征谱带可鉴定出红辉狮子、百花选、芳纪、海黄、火鸟、新日月、岛大臣、金晃、黑龙
表421个牡丹品种的DNA指纹图谱
表示有电泳条带，0表示无电泳条带。品种编号同表1。
锦、八千代椿10个品种；用引物P5扩增出的特征谱带可区分鉴定出岛辉与日暮、岛锦与花王、花竞与连鹤、皇嘉门与新扶桑、玉廉与紫晃等。
2.3遗传多样性分析
通过计算遗传系数矩阵，利用NTsys软件绘制聚类分析图（图2），结果表明，21个日本牡丹品种间遗传相似系数变异范围在0.21～0.84之间。以遗传相似系数0.55为阈值，可以将21种牡丹品种分为2大类：第1类包括百花选、花竞、火鸟、红辉狮子、芳纪、连鹤、黑龙锦、新扶桑、新日月、岛大臣、金晃、黄嘉门和八千代椿共13个牡丹品种；第2类包括岛锦、岛辉、日暮、玉廉、海黄、紫晃、吉野川和花王8个牡丹品种。以遗传系数0.65为阈值，又可以将21个品种分为5个类群：第1类群包括芳纪、连鹤、黑龙锦、新扶桑、新日月、岛大臣、金晃、皇嘉门和八千代椿9个品种；第2类群包括百花选、花竞、火鸟和红辉狮子4个品种；第3类群只有花王1个品种；第4类群包括海黄、紫晃和吉野川3个品种；第5类群包括岛锦、岛辉、玉廉和日暮4个品种。
3讨论
本试验以中国常熟尚湖牡丹园引栽的日本牡丹品种为研究对象，拟构建尚湖牡丹园日本牡丹品种的DNA指纹数据库，在分子水平上给每个引栽品种1个能准确表明其身份的指纹信息，从而实现DNA指纹技术应用于牡丹品种鉴定、引种。引物组合法通过不同的有限组合，可以大大提高引物的鉴别能力[12-13]，本研究采用2对引物进行组合鉴别可将21份日本牡丹品种完全区分开，随着品种数量的进一步增加，这2个引物组合的鉴别能力可能会逐渐降低，可根据实际情况适当增加引物组合的数量。多对核心引物组合构建的指纹图谱相比2个引物组合所代表的DNA水平上的信息量更丰富、更全面、更准确，具有更强的品种鉴别能力，适用于更大牡丹品种DNA指纹数据库的构建需要。
本研究的遗传多样性分析表明，引栽的21个日本牡丹品种间的遗传相似系数介于0.21～0.84之间，品种间存在较复杂的遗传差异。聚类分析表明，百花选、花竞、火鸟、红辉狮子、芳纪、连鹤、黑龙锦、新扶桑、新日月、岛大臣、金晃、黄嘉门和八千代椿等品种聚合在一起，可能来自于同一起源；岛锦、岛辉、日暮、玉廉、海黄、紫晃、吉野川和花王等品种相互间亲缘关系较近。
参考文献：
[1]朱红霞. 牡丹、芍药品种DNA指纹图谱绘制的初步研究[D]. 北京：北京林业大学，2004.
[2]Hosoki T，Kimura D，Hasegawa R. Comparative study of tree peony （Paeonia suffruticosa Andr.） cultivars and hybrids random amplified polymorphic DNA （RAPD） analysis[J]. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science，1997，66（2）：393-400.
[3]UPOV. Guidelines for DNA-profoling：molecular marker selection and database construction//BMT Gridelines （proj.9）[M]. Geneva：UPOV，2007：3-4.
[4]李保印. 中原牡丹品种遗传多样性与核心种质构建研究[D]. 北京：北京林业大学，2007.
[5]王淼，于恒秀，龚志云，等. 芍药栽培品种ISSR反应体系的优化和应用[J]. 扬州大学学报：农业与生命科学版，2007，28（2）：78-82.
[6]林玲，汤浩茹，刘燕，等. 观赏桃ISSR-PCR反应体系的优化[J]. 生物技术通报，2009（12）：72-75.
[7]郭大龙. 牡丹种质资源遗传多样性研究进展[J]. 北方园艺，2007（9）：61-65.
[8]Temnykh S，DeClerck G，Lukashova A，et al. Computational and experimental analysis of microsatellites in rice （Oryza sativa L.）：Frequency，length variation，transposon associations，and genetic marker potential[J]. Genome Research，2001，11：1441-1452.
[9]张艳丽，王雁，李正红，等. 基于牡丹EST信息的滇牡丹SSR标记开发[J]. 林业科学研究，2011，24（2）：171-175.
[10]成仿云，李嘉珏. 中国牡丹的输出及其在国外的发展Ⅰ：栽培牡丹[J]. 西北师范大学学报：自然科学版，1998，34（1）：109-116.
[11]王凤格，赵久然，郭景伦，等. 一种改进的玉米SSR标记的PAGE/快速银染检测新方法[J]. 农业生物技术学报，2004，12（5）：606-607.
[12]徐海风，杨加银，程保山. 26份菜用大豆品种（系）指纹图谱的构建及其遗传多样性分析[J]. 江苏农业科学，2014，42（5）：145-148.
[13]匡猛，杨伟华，许红霞，等. 中国棉花主栽品种DNA指纹图谱构建及SSR标记遗传多样性分析[J]. 中国农业科学，2011，44（1）：20-27.
关键词：EST-SSR；DNA指纹图谱；遗传多样性；牡丹品种
中图分类号： S685.11文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0050-04
收稿日期：2014-09-21
基金项目：江苏农业科技支撑计划（编号：BE2011445）；江苏省大学生实践创新训练计划（编号：201310333032Y）；江苏省苏州市科技计划（编号：SZS201102、SYN201110、SNG201323）；苏州市吴江区科技计划（编号：WN201311、WN201317）；江苏省常熟市科技计划（编号：CS201205）。
作者简介：孙嘉磊（1992—），男，江苏太仓人，研究方向为植物资源利用开发。
通信作者：杨志刚，硕士，副教授，从事天然产物研究与开发。Tel：（0512）52251562；E-mail：zhigangyang77@sina.cn。牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews.）花大色艳，花香袭人，有“国色天香”之美誉，深受人们喜爱。关于DNA指纹技术在牡丹品种鉴别上的应用，前人做了很多研究。朱红霞利用AFLP标记对牡丹品种的分类进行了初步探索[1]。Hosoki等利用RAPD标记技术对牡丹品种和野生牡丹品种的DNA序列进行了尝试性分析[2]。由于技术比较成熟，以微卫星序列为基础的SSR标记成为当前植物品种DNA指纹图谱数据库的首选标记[3]。李保印利用SSR标记技术研究中原牡丹品种初级核心种质和遗传多样性，并建立了核心种质[4]。王淼等研究讨论了牡丹品种的SSR-PCR反应条件[5]。SSR分子标记技术可以用来区分牡丹品种，这是不容争辩的事实[6]，近年来EST（expressed sequence tages）发展十分迅速，而EST-SSR与其他鉴别途径相比，是一种相对准确、简便、经济的途径[7]。Temnykh 等研究显示，他们所发现的牡丹EST-SSR位点绝大多数都具有多态性潜能[8]。张艳丽等以6个滇牡丹不同花色类群DNA为模板，对EST-SSR引物进行了筛选[9]。
牡丹品种的起源地在中国，在中国牡丹园艺栽培不断发展的同时，日本也早就开始进行牡丹园艺品种的杂交培育和引种工作，形成了具有地方特色的牡丹品种群[10]，而目前针对国内引栽的日本品系牡丹开展DNA指纹图谱构建及遗传多样性的研究还未见报道。本研究采用EST-SSR标记构建中国常熟尚湖牡丹园21份日本品系牡丹品种的DNA指纹图谱并进行遗传多样性分析，以期为牡丹品种DNA指纹鉴定提供技术支持。
1材料与方法
1.1供试材料
21份牡丹品种为中国常熟尚湖牡丹园引栽的日本牡丹品种，详见表1。
表1供试21份日本牡丹主栽品种概况
编号品种名称花色编号品种名称花色1岛锦复色12岛大臣紫2岛辉红13金晃黄3日暮红14海黄黄4百花选红15玉廉白5火鸟红16连鹤白6花王深银红17黑龙锦墨紫7芳纪火红18新扶桑白8新日月红19八千代椿银红9红辉狮子大红20吉野川粉10花竞粉21紫晃粉11皇嘉门黑紫
1.2DNA提取
按照CTAB法提取牡丹基因组DNA，操作流程如下：（1）在研钵中加入100 mg牡丹叶片样品和700 μL CTAB提取液，充分研磨；（2）转移混合液至1.5 mL离心管中，65 ℃水浴 30 min，每隔5 min振荡混匀；（3）取出离心管，冷却到室温后，于8 000 r/min离心2 min；（4）取出离心管，将上清液转移至1.5 mL离心管中，加入等体积三氯甲烷混匀，振荡10 min；（5）12 000 r/min常温离心10 min；（6）转移上清液至1.5 mL离心管中，加等体积异丙醇，混匀后静置10 min，于 12 000 r/min 离心10 min，弃上清液，用70%～75%乙醇漂洗沉淀2次，在超净工作台上吹干；（7）加50 μL ddH2O，将沉淀DNA溶解后于4 ℃冰箱保存备用。
1.3引物信息
以张艳丽等对滇牡丹不同花色类群开发的10对EST-SSR引物[9]作为本研究的候选引物（表2），引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化。
20 μL反应液中包括10×PCR buffer、0.1 mmol/L dNTP、1 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L Mg2 、50 ng DNA模版和 03 μmol/L EST-SSR引物。反应程序：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物选用60 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，36 W电泳3 h。参考王凤格等的快速银染法[11]并稍加修改：50%乙醇、2.5%冰乙酸组成的固定液固定5 min；双蒸水快速漂洗1次；0.2%AgNO3染色5 min；15% NaOH、0.4%甲醛组成的显影液显影；固定液定影。 1.5数据分析
根据EST-SSR扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，观察稳定且易于辨别的差异性条带，选出具有多态性的引物，记录并进行统计分析，建立其DNA指纹图谱。统计每对引物扩增的条带数，计算多态性频率（frequency of polymorphism，FP）。用Excel计算物种间相似系数（GS）和遗传距离指数（D），根据所得遗传系数矩阵用NTSYS2.1软件进行统计分析并作聚类分析图。
2结果与分析
2.1EST-SSR标记多态性分析
10对EST-SSR引物及相应产物片段信息见表2。用10对SSR标记引物在21份供试品牡丹中共检测到47个多态性基因型（表3），每对引物的基因型数不等，变幅为1～11个，平均4.7个，这些引物对所有供试材料的扩增结果重复性好、特异性高、条带清晰且多态性丰富（图1）。其中引物P10扩增的基因型最多，为11个；P1基因型最少，为1个，多态性最差。10对SSR引物的FP值平均为0.521，其中FP值最大为P1的0.950，其次是P6的0.607，最小为P8的0.277。各标记的多态性存在明显的差异，多态性位点多且FP值越高，表明相应标记对牡丹品种的鉴别能力越好，如P10。
表3EST-SSR引物扩增的信息
位点重复基元基因型数（个）FP值P1（CTC）410.950P2（GCA）470.523 P3（AAG）420.440 P4（TTAA）330.467P5（TCTCGC）370.538 P6（AGA）530.607 P7（CATTT）370.349 P8（ACTGA）340.277 P9（CAC）420.523P10（GGT）4110.542
2.2DNA指纹图谱分析
采用上述10对EST-SSR引物对21个品种进行指纹分析，挑选出多态性相对丰富的引物进行组合鉴别，选择P5、P10共2对核心引物进行组合就可将21份供试牡丹品种完全区分开（表4）。其中用P10扩增出的特征谱带可鉴定出红辉狮子、百花选、芳纪、海黄、火鸟、新日月、岛大臣、金晃、黑龙
表421个牡丹品种的DNA指纹图谱
表示有电泳条带，0表示无电泳条带。品种编号同表1。
锦、八千代椿10个品种；用引物P5扩增出的特征谱带可区分鉴定出岛辉与日暮、岛锦与花王、花竞与连鹤、皇嘉门与新扶桑、玉廉与紫晃等。
2.3遗传多样性分析
通过计算遗传系数矩阵，利用NTsys软件绘制聚类分析图（图2），结果表明，21个日本牡丹品种间遗传相似系数变异范围在0.21～0.84之间。以遗传相似系数0.55为阈值，可以将21种牡丹品种分为2大类：第1类包括百花选、花竞、火鸟、红辉狮子、芳纪、连鹤、黑龙锦、新扶桑、新日月、岛大臣、金晃、黄嘉门和八千代椿共13个牡丹品种；第2类包括岛锦、岛辉、日暮、玉廉、海黄、紫晃、吉野川和花王8个牡丹品种。以遗传系数0.65为阈值，又可以将21个品种分为5个类群：第1类群包括芳纪、连鹤、黑龙锦、新扶桑、新日月、岛大臣、金晃、皇嘉门和八千代椿9个品种；第2类群包括百花选、花竞、火鸟和红辉狮子4个品种；第3类群只有花王1个品种；第4类群包括海黄、紫晃和吉野川3个品种；第5类群包括岛锦、岛辉、玉廉和日暮4个品种。
3讨论
本试验以中国常熟尚湖牡丹园引栽的日本牡丹品种为研究对象，拟构建尚湖牡丹园日本牡丹品种的DNA指纹数据库，在分子水平上给每个引栽品种1个能准确表明其身份的指纹信息，从而实现DNA指纹技术应用于牡丹品种鉴定、引种。引物组合法通过不同的有限组合，可以大大提高引物的鉴别能力[12-13]，本研究采用2对引物进行组合鉴别可将21份日本牡丹品种完全区分开，随着品种数量的进一步增加，这2个引物组合的鉴别能力可能会逐渐降低，可根据实际情况适当增加引物组合的数量。多对核心引物组合构建的指纹图谱相比2个引物组合所代表的DNA水平上的信息量更丰富、更全面、更准确，具有更强的品种鉴别能力，适用于更大牡丹品种DNA指纹数据库的构建需要。
本研究的遗传多样性分析表明，引栽的21个日本牡丹品种间的遗传相似系数介于0.21～0.84之间，品种间存在较复杂的遗传差异。聚类分析表明，百花选、花竞、火鸟、红辉狮子、芳纪、连鹤、黑龙锦、新扶桑、新日月、岛大臣、金晃、黄嘉门和八千代椿等品种聚合在一起，可能来自于同一起源；岛锦、岛辉、日暮、玉廉、海黄、紫晃、吉野川和花王等品种相互间亲缘关系较近。
参考文献：
[1]朱红霞. 牡丹、芍药品种DNA指纹图谱绘制的初步研究[D]. 北京：北京林业大学，2004.
[2]Hosoki T，Kimura D，Hasegawa R. Comparative study of tree peony （Paeonia suffruticosa Andr.） cultivars and hybrids random amplified polymorphic DNA （RAPD） analysis[J]. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science，1997，66（2）：393-400.
[3]UPOV. Guidelines for DNA-profoling：molecular marker selection and database construction//BMT Gridelines （proj.9）[M]. Geneva：UPOV，2007：3-4.
[4]李保印. 中原牡丹品种遗传多样性与核心种质构建研究[D]. 北京：北京林业大学，2007.
[5]王淼，于恒秀，龚志云，等. 芍药栽培品种ISSR反应体系的优化和应用[J]. 扬州大学学报：农业与生命科学版，2007，28（2）：78-82.
[6]林玲，汤浩茹，刘燕，等. 观赏桃ISSR-PCR反应体系的优化[J]. 生物技术通报，2009（12）：72-75.
[7]郭大龙. 牡丹种质资源遗传多样性研究进展[J]. 北方园艺，2007（9）：61-65.
[8]Temnykh S，DeClerck G，Lukashova A，et al. Computational and experimental analysis of microsatellites in rice （Oryza sativa L.）：Frequency，length variation，transposon associations，and genetic marker potential[J]. Genome Research，2001，11：1441-1452.
[9]张艳丽，王雁，李正红，等. 基于牡丹EST信息的滇牡丹SSR标记开发[J]. 林业科学研究，2011，24（2）：171-175.
[10]成仿云，李嘉珏. 中国牡丹的输出及其在国外的发展Ⅰ：栽培牡丹[J]. 西北师范大学学报：自然科学版，1998，34（1）：109-116.
[11]王凤格，赵久然，郭景伦，等. 一种改进的玉米SSR标记的PAGE/快速银染检测新方法[J]. 农业生物技术学报，2004，12（5）：606-607.
[12]徐海风，杨加银，程保山. 26份菜用大豆品种（系）指纹图谱的构建及其遗传多样性分析[J]. 江苏农业科学，2014，42（5）：145-148.
[13]匡猛，杨伟华，许红霞，等. 中国棉花主栽品种DNA指纹图谱构建及SSR标记遗传多样性分析[J]. 中国农业科学，2011，44（1）：20-27.