【摘 要】
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目的通过对C3H10T1/2细胞进行成骨及成软骨分化,利用微小RNA(microRNA,miRNA)芯片技术筛选成骨分化和成软骨分化中差异miRNA,以期寻找调节C3H10T1/2细胞成骨及成软骨分化的特
【机 构】
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四川大学华西医院骨科,四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室·干细胞与组织工程研究室,
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目的通过对C3H10T1/2细胞进行成骨及成软骨分化,利用微小RNA(microRNA,miRNA)芯片技术筛选成骨分化和成软骨分化中差异miRNA,以期寻找调节C3H10T1/2细胞成骨及成软骨分化的特异性miRNA。方法取C3H10T1/2细胞系,分别行成骨和成软骨诱导分化,对诱导组和对照组进行鉴定。然后通过miRNA芯片技术筛选分化前后2倍变化幅度且平均标准化信号值>2的差异miRNA,并行实时荧光定量PCR(real-time fl uorescence quantitative PCR,RT-qPCR)验证。结果诱导7 d成骨诱导组较对照组有明显ALP表达(P<0.05);诱导7、14、21 d,RT-qPCR检测成骨诱导组成骨标志物Runx2、丝氨酸蛋白酶7(serine protease 7,Sp7)、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)mRNA相对表达量均显著高于诱导0 d时(P<0.05);诱导21 d,Western blot检测成骨诱导组Runx2、Sp7、Ⅰ型胶原、OPN蛋白表达量明显高于对照组(P<0.05)。成软骨诱导5、10、15 d,RT-qPCR检测成软骨诱导组软骨标志物SOX9、Ⅱ型胶原、蛋白多糖(Aggrecan)、透明质酸合成酶(Has2)mRNA相对表达量均显著高于诱导0 d时(P<0.05);诱导15 d,Western blot检测成软骨诱导组SOX9、Ⅱ型胶原、Aggrecan、Has2蛋白表达量明显高于对照组(P<0.05)。通过miRNA芯片技术分别筛选出10个成骨和3个成软骨2倍变化幅度且平均标准化信号值>2的差异miRNA。除miR-455-3p之外,其余差异miRNA验证结果与芯片结果比较有较好一致性。结论通过miRNA芯片技术对C3H10T1/2细胞系以及其诱导成骨和成软骨分化细胞进行检测对比,发现部分miRNA表达量在诱导后细胞中发生变化,为进一步挑选成骨和成软骨特异性miRNA进行功能验证和靶基因预测奠定了基础。
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