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摘 要：以浙江省磐安浙贝母（Fritillaria thunbergii Miq.）为研究对象，利用PCR-DGGE技术，研究连作对浙贝母根际土壤细菌群落结构的影响。结果表明，连作条件下浙贝母根际土壤细菌群落结构发生改变，主要表现为细菌种群数量显著减少;但連作年限对浙贝母根际土壤细菌多样性的影响较小，细菌群落结构变化不明显。对浙贝母根际土壤细菌种群的DGGE电泳结果进行主成分分析，分析结果显示，所取浙贝母土壤样品的细菌优势种群为蜡样芽胞杆菌群（Bacillus cereus.Frankland）、芽胞杆菌属（Bacillus Cohn）和鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）。综上表明，浙贝母连作后根际土壤细菌群落结构和功能的改变可能是导致浙贝母连作障碍产生的重要原因之一。
关键词：浙贝母;连作;根际土壤;细菌群落
一、材料与方法
1.实验材料.浙贝母根际土壤样品采自浙江省磐安塘下村种植大田。土壤以红壤为主，浙贝母种植基本为连作种植，除连作年限外土壤处理背景一致。取浙贝母未连作土壤、连作2年土壤、连作多年根际土壤样品。
2.研究方法
（1）取样方法，去除2～3 cm的表层土，完整挖出浙贝母的全部根系，将大块土抖落，取附着在根系上的细土至干净的取样袋中，不同连作年限的浙贝母根际土壤各取三份作为实验组，取未连作土壤三份作为对照。采样后密封保存在4℃冰箱中。
（2）土壤DNA的提取纯化，釆用OMEGA的E.Z.N.A.Soil DNA Kit试剂盒提取浙贝母根际土壤的微生物总DNA。
（3）16S rDNA V3 片段 PCR 扩增。扩增目的DNA为细菌16S部分核糖体核苷酸序列。PCR程序模式为touchdown-PCR程序。反应总体系为ddH2O 17 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，Primer 534 1 μL，Primer 341-GC 1 μL，Ex Tag酶0.5 μL和DNA模板1 μL。扩增后的PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
（4）变性梯度凝胶电泳，配置高低两种浓度的凝胶溶液，加入40 μL 10%过硫酸铵与10 μL TEMED，并迅速涡旋注入连通柱。打开连通阀并运转蠕动泵，转速为15 rpm。待凝胶溶液注入玻板指定高度后，将泵管置于废液缸，立即往灌胶器中注满MQ，开始清洗。
在电泳槽中注入1×TAE缓冲液。放入加热罩后设置缓冲液加热温度为65℃。待胶凝固，往玻璃板中插入样梳，并使之倾斜，用移液枪灌注上层胶，加入4 mL后，将样梳摆正。待胶凝固，拔出样梳，用1×TAE清洗。每个点样孔上样液为PCR产物15 μL、3×loading buffer 7.5 μL。将电泳液温度设置为60℃，电泳为50 V，13 h。当电泳结束，切去上层胶，并在上样端切角标记。本实验采用银染法进行染胶。染色结束后用Bio-Rad Gel Doc 2000凝胶成像系统对观察到的结果进行拍照，最后用Bio-Rad Quantity One软件对DGGE条带进行分析。
（5）割胶回收与克隆测序。挑选DGGE电泳胶上的优势条带并进行割胶回收，之后进行纯化。纯化产物用pMD-18-T载体进行克隆。选取较亮的PCR条带所代表的菌液作为测序菌液进行分装，送至上海生工公司进行测序。
二、结果与分析
PCR扩增产物经DGGE检测后获得多条清晰条带。条带随着连作年限增加亮度降低，连作多年的浙贝母土壤样品较连作两年的DGGE条带亮度变化较小，个别条带在亮度上有差别。从条带数量上看，随着连作年限增加，DGGE条带数目逐渐减少。同样，连作多年的土壤样品较连作两年的土壤样品DGGE条带数量变化不明显。DGGE电泳条带数可以近似认为是细菌种群的数量，而条带的亮度则反映了该种细菌数量的多少[8]。据此初步推断，连作导致浙贝母根际土壤细菌种群的数量减少，影响了根际土壤中细菌群落的组成。
通过测序结果可知，浙贝母连作两年与连作多年土壤样品中细菌种群数较未连作土壤样品中细菌种群数显著减少。但连作多年土壤样品中细菌种群数量和连作两年土壤样品中细菌种群数量无明显差别。随着连作年限的增加，个别种群的细菌数量也逐渐减少，可以从同一层次的条带亮度逐渐降低看出。连作两年的土壤样品中，条带1B、2B、3B和9B特别亮，经序列分析，推断其为蜡样芽胞杆菌群、芽胞杆菌属及鞘氨醇单胞菌属，相似菌株最大相似度分别为99%、99%和100%。连作多年的土壤样品中，上述菌数量减少，其条带亮度降低。据此推断，在连作条件下，浙贝母根际土壤细菌群落结构发生变化，土壤微生态环境改变，影响了浙贝母的生长。而土壤细菌群落结构和功能的改变，与连作障碍有着密不可分的关系。
3 讨论
在连作情况下，浙贝母根际土壤细菌群落结构多样性指数低于未连作状态，随着连作年限增长，细菌种群数量减少并不明显。对根际土壤细菌群落的DGGE结果进行主成分分析，结果表明，连作后土壤细菌群落结构组成有明显变化，土壤中优势种群为蜡样芽胞杆菌群、芽胞杆菌属和鞘氨醇单胞菌属。研究发现，作物连作后对土壤根际微生物的生长繁殖具有选择性，能够促进或抑制某些微生物生长，进而改变微生物种群的多样性。根际土壤微生物功能的差异会影响植物所需营养物质的提供[9]，而植物对土壤中营养物质的选择，可能是导致连作障碍产生的原因。
由以上讨论可知，连作后浙贝母根际土壤细菌群落组成及功能的改变，使得浙贝母根际土壤微生态环境发生了变化，这与浙贝母连作障碍相关。但连作后浙贝母根际微生物群落除了上述菌落外，其结构组成中还有哪些菌群发生了比较大的改变，以及它们与浙贝母连作障碍的机理关系还有待进一步研究。
参考文献
[1]张明发，沈雅琴.浙贝母药理研究进展[J].上海医药，2007.28（10）：459-461.
[2]中国医学科学院药物研究所.中药志[M].北京：人民卫生出版社，1959，148-152.
[3]赵鹂.丽水市浙贝母产业化发展策略与规范化生产技术研究[D].浙江杭州：浙江大学，2004.
（作者单位：浙江师范大学，化学与生命科学学院）
关键词：浙贝母;连作;根际土壤;细菌群落
一、材料与方法
1.实验材料.浙贝母根际土壤样品采自浙江省磐安塘下村种植大田。土壤以红壤为主，浙贝母种植基本为连作种植，除连作年限外土壤处理背景一致。取浙贝母未连作土壤、连作2年土壤、连作多年根际土壤样品。
2.研究方法
（1）取样方法，去除2～3 cm的表层土，完整挖出浙贝母的全部根系，将大块土抖落，取附着在根系上的细土至干净的取样袋中，不同连作年限的浙贝母根际土壤各取三份作为实验组，取未连作土壤三份作为对照。采样后密封保存在4℃冰箱中。
（2）土壤DNA的提取纯化，釆用OMEGA的E.Z.N.A.Soil DNA Kit试剂盒提取浙贝母根际土壤的微生物总DNA。
（3）16S rDNA V3 片段 PCR 扩增。扩增目的DNA为细菌16S部分核糖体核苷酸序列。PCR程序模式为touchdown-PCR程序。反应总体系为ddH2O 17 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，Primer 534 1 μL，Primer 341-GC 1 μL，Ex Tag酶0.5 μL和DNA模板1 μL。扩增后的PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
（4）变性梯度凝胶电泳，配置高低两种浓度的凝胶溶液，加入40 μL 10%过硫酸铵与10 μL TEMED，并迅速涡旋注入连通柱。打开连通阀并运转蠕动泵，转速为15 rpm。待凝胶溶液注入玻板指定高度后，将泵管置于废液缸，立即往灌胶器中注满MQ，开始清洗。
在电泳槽中注入1×TAE缓冲液。放入加热罩后设置缓冲液加热温度为65℃。待胶凝固，往玻璃板中插入样梳，并使之倾斜，用移液枪灌注上层胶，加入4 mL后，将样梳摆正。待胶凝固，拔出样梳，用1×TAE清洗。每个点样孔上样液为PCR产物15 μL、3×loading buffer 7.5 μL。将电泳液温度设置为60℃，电泳为50 V，13 h。当电泳结束，切去上层胶，并在上样端切角标记。本实验采用银染法进行染胶。染色结束后用Bio-Rad Gel Doc 2000凝胶成像系统对观察到的结果进行拍照，最后用Bio-Rad Quantity One软件对DGGE条带进行分析。
（5）割胶回收与克隆测序。挑选DGGE电泳胶上的优势条带并进行割胶回收，之后进行纯化。纯化产物用pMD-18-T载体进行克隆。选取较亮的PCR条带所代表的菌液作为测序菌液进行分装，送至上海生工公司进行测序。
二、结果与分析
PCR扩增产物经DGGE检测后获得多条清晰条带。条带随着连作年限增加亮度降低，连作多年的浙贝母土壤样品较连作两年的DGGE条带亮度变化较小，个别条带在亮度上有差别。从条带数量上看，随着连作年限增加，DGGE条带数目逐渐减少。同样，连作多年的土壤样品较连作两年的土壤样品DGGE条带数量变化不明显。DGGE电泳条带数可以近似认为是细菌种群的数量，而条带的亮度则反映了该种细菌数量的多少[8]。据此初步推断，连作导致浙贝母根际土壤细菌种群的数量减少，影响了根际土壤中细菌群落的组成。
通过测序结果可知，浙贝母连作两年与连作多年土壤样品中细菌种群数较未连作土壤样品中细菌种群数显著减少。但连作多年土壤样品中细菌种群数量和连作两年土壤样品中细菌种群数量无明显差别。随着连作年限的增加，个别种群的细菌数量也逐渐减少，可以从同一层次的条带亮度逐渐降低看出。连作两年的土壤样品中，条带1B、2B、3B和9B特别亮，经序列分析，推断其为蜡样芽胞杆菌群、芽胞杆菌属及鞘氨醇单胞菌属，相似菌株最大相似度分别为99%、99%和100%。连作多年的土壤样品中，上述菌数量减少，其条带亮度降低。据此推断，在连作条件下，浙贝母根际土壤细菌群落结构发生变化，土壤微生态环境改变，影响了浙贝母的生长。而土壤细菌群落结构和功能的改变，与连作障碍有着密不可分的关系。
3 讨论
在连作情况下，浙贝母根际土壤细菌群落结构多样性指数低于未连作状态，随着连作年限增长，细菌种群数量减少并不明显。对根际土壤细菌群落的DGGE结果进行主成分分析，结果表明，连作后土壤细菌群落结构组成有明显变化，土壤中优势种群为蜡样芽胞杆菌群、芽胞杆菌属和鞘氨醇单胞菌属。研究发现，作物连作后对土壤根际微生物的生长繁殖具有选择性，能够促进或抑制某些微生物生长，进而改变微生物种群的多样性。根际土壤微生物功能的差异会影响植物所需营养物质的提供[9]，而植物对土壤中营养物质的选择，可能是导致连作障碍产生的原因。
由以上讨论可知，连作后浙贝母根际土壤细菌群落组成及功能的改变，使得浙贝母根际土壤微生态环境发生了变化，这与浙贝母连作障碍相关。但连作后浙贝母根际微生物群落除了上述菌落外，其结构组成中还有哪些菌群发生了比较大的改变，以及它们与浙贝母连作障碍的机理关系还有待进一步研究。
参考文献
[1]张明发，沈雅琴.浙贝母药理研究进展[J].上海医药，2007.28（10）：459-461.
[2]中国医学科学院药物研究所.中药志[M].北京：人民卫生出版社，1959，148-152.
[3]赵鹂.丽水市浙贝母产业化发展策略与规范化生产技术研究[D].浙江杭州：浙江大学，2004.
（作者单位：浙江师范大学，化学与生命科学学院）