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摘要 [目的] 明确微生物发酵液对灰霉病菌的防治作用。[方法]通过室内毒力测定和田间药效试验研究了微生物发酵液对灰霉病菌的抑制作用和田间防效。[结果]毒力测定结果表明，微生物发酵液能明显抑制灰霉病菌菌丝的生长，发酵液原液的抑制率最高为66.18%。田间试验结果表明，对番茄间隔7 d、连续施药3次，第3次施药7 d后，微生物发酵液原液对灰霉病的防效最高达60.47%，与35%的腐霉利600倍液的防治效果无显著差异。[结论]微生物发酵液对番茄灰霉病有较好的防治效果，其作为一种生物新型杀菌剂值得进一步研究、开发和利用。
关键词 微生物发酵液;灰霉菌;防治效果
中图分类号 S436.412.1+3文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）21-0145-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.043
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Control Effects of Microbial Fermentation Liquid on Tomato Gray Mould in Protected Field
LIU Xiaomei，LIANG Changdong，LI Jingfang et al
（Lianyungang Academy of Agricultural Sciences， Lianyungang，Jiangsu 222000 ）
Abstract [Objective] To study the effect of microbial fermentation liquid on controlling gray mould. [Method] Toxicity experiments and field trials were conducted. [Result] Toxicity experiments showed that the microbial fermentation liquid could significantly inhibit the growth of Botrytis cinerea， and the inhibition rate of the fermentation liquid was 66.18%. In the field trials， the control effect of microbial fermentation liquid on grey mold was 60.47% 7 days after the third treatment， which was no significant difference from the control effect of 600fold dilution of 35% saprophytic. [Conclusion] The microbial fermentation liquid had control effect on tomato Botrytis cinerea， as a new biological fungicide， it was worthy of further research， development and utilization.
Key words Microbial fermentation liquid;Tomato gray mould;Control effect
基金項目 连云港市财政专项（QNJJ1719）。
作者简介 刘晓梅（1987—），女，河南偃师人，助理研究员，硕士，从事植物保护研究。 通信作者，副教授，从事作物栽培及资源与坏境研究。
收稿日期 2019-07-17
番茄灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的真菌性气传病害。近年来随着保护地番茄种植面积的不断增加，灰霉病菌在土壤中大量累积，特别是在冬春季节最容易发生，且常暴发式扩增，严重影响番茄的产量和品质[1]，给农业生产带来巨大损失[2]。目前，保护地番茄灰霉病防治主要以化学药剂[3-4]为主，然而化学农药的长期施用往往会造成灰霉病菌的抗药性增加，且防治效果逐步降低[5-7]，另外还会导致病害的流行[8]。同时，化学农药残留问题比较严重，且越来越引起人们的关注，尤其是对鲜食果蔬，给环境及人畜健康带来严重威胁[9]。因此，探索生物新型杀菌剂来替代常规化学农药对保护地蔬菜种植具有积极的影响。
连云港市农业科学院资源与环境研究室制备的微生物发酵液是利用纳豆芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌进行发酵，而这3种微生物对多种病原菌均具有良好的杀菌效果，目前已有大量研究[10-18]，但其混合发酵液的杀菌作用效果还不明确。笔者通过室内毒力测定及田间药效试验进一步证实该微生物发酵液对保护地番茄灰霉病的杀菌效果，旨在为新型高效生物杀菌剂的开发和应用提供理论和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试番茄。番茄品种为中蔬四号，购于中国农业科学院蔬菜花卉研究所。
1.1.2 供试药剂。微生物发酵液由连云港市农业科学院资源与环境研究室提供，35%腐霉利悬浮剂购于四川宜宾川安高科农药有限公司。
1.1.3 病原菌。灰葡萄孢（Botrytis cinerea）斜面购于北京北纳创联生物技术研究院。
1.1.4 PDA培养基。马铃薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾3 g，硫酸镁1.5 g，维生素B1 10 mg，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。 1.2 方法
1.2.1 灰葡萄孢斜面转接。
从灰葡萄孢斜面取0.5 cm×0.5 cm正方形菌块接种在PDA平板培养基上，正置放入培养箱，25～28 ℃培养，待菌丝长满平板保存待用。
1.2.2 微生物发酵液对灰霉病菌菌丝生长抑制作用的测定。
采用生长速率法测定。将PDA培养基熔化，待冷却至45～50 ℃时，在无菌操作条件下倒入灭菌培养皿中，每皿10～15 mL培养基，摇匀后冷却凝固。将微生物发酵液配成不同浓度（原液、5倍、10倍、20倍、40倍稀释），以化学试剂腐霉利和清水作对照。取消毒烧杯，标记药剂名称及浓度，分别盛取药液，再用灭菌镊子夹取消毒滤纸片（直径4～5 mm）分别投入药液中，然后把浸透的滤纸片按顺序列于距培养基中央2.3 cm处，每皿放4片，并在培养皿底面加标签。夹取滤纸片时应在烧杯壁上停留片刻，让多余的药液流去。最后将 PDA 平板上培养7 d的灰葡萄孢霉打成直径 6 mm的菌饼，接种于 PDA 培养皿中央。每个处理5次重复。置于25 ℃左右恒温培养箱中培养，培养5 d后用十字交叉法测量菌落直径。
抑制百分率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径×100%
1.2.3 微生物发酵液对番茄灰霉病菌田间防治效果测定。
1.2.3.1 试验设计。
将微生物发酵液配成不同浓度（原液、5倍、10倍、20倍、40倍稀释），以腐霉利和清水作对照，选取长势一致3叶1心的植株幼苗作处理，每个处理20株，共3个重复。
1.2.3.2 施药时间与方法。
2019年1月3日第1次喷药，1月10日和1月17日进行第2、3次施药，共3次，采用小喷壶进行喷洒番茄植株叶正反面，做到湿而不滴。
1.2.3.3 调查方法和分级标准。
发病初期喷药前进行病情调查，每次施药后7 d调查病害情况。每小区5点取样，每点取5株，每株调查所有叶片上病斑面积占整株叶片的百分比进行分级。按以下[19]标准进行病害分级。根据病害调查结果计算病情指数和防治效果。数据采用邓肯氏新复极差法（DMRT）进行统计分析。
0级：叶片、果实无病;1级：病斑面积占整个叶、果面的5%以下;3级：病斑面积占整个叶、果面的6%～15%;5级：病斑面积占整个叶、果面的16%～25%;7级：病斑面積占整个叶、果面的26%～50%;9级：病斑面积占整个叶、果面的50%以上;
病情指数=100×[（各级病叶数×病害级别数）]/（调查总叶数×9）
防治效果=[1-（CK0×PT1）/（CK1×PT0）]×100%
式中，CK0为空白对照区施药前病情指数;CK1为空白对照区施药后病情指数;PT0为药剂处理区施药前病情指数;PT1为药剂处理区施药后病情指数。
2 结果与分析
2.1 微生物发酵液对番茄灰霉菌菌丝生长的抑制作用
采用生长速率法测定微生物发酵液对灰霉病菌菌丝生长的抑制作用。结果表明，微生物发酵液对灰霉病菌菌丝生长具有明显的抑制作用（表1），且抑制作用随着发酵液稀释倍数的增加而逐步降低，其中发酵液原液对灰霉病菌菌丝生长的抑制率最高达66.26%，其次是发酵液5倍稀释液、10倍稀释液且之间无显著差异，20倍、40倍稀释液抑制作用效果最小。
2.2 微生物发酵液对保护地番茄灰霉病的田间防治效果
微生物发酵液对保护地番茄灰霉病的防治效果（表2）表明，在第1次喷施后7 d，微生物发酵液原液对灰霉病菌的防效最高可达48.24%，与35%腐霉利600倍液药剂对照、微生物发酵液5倍稀释液均无显著差异;其次是发酵液10倍稀释液，防效最低的是20、40倍稀释液且两者之间无显著差异;第2次喷施后7 d，发酵液原液的防效达58.15%，显著低于35%腐霉利600倍液药剂防效72.10%，且显著高于发酵液其他稀释液处理组的防治效果，随着发酵液稀释倍数的增加防效逐渐降低，其中5倍与10倍稀释液，20倍与40倍稀释液处理之间的防效均无显著差异;第3次喷施后7 d，微生物发酵液原液的防治效果达60.47%，显著高于其他各稀释倍数处理，与35%腐霉利600倍液药剂处理的防治效果无显著差异。随着发酵液稀释倍数的增加防效逐渐降低，且20倍与40倍稀释液处理之间的防效均无显著差异。综上可知，在3次施药过程中，微生物发酵液不同处理组对番茄灰霉病的防治效果逐渐增加，发酵液原液在第3次喷药后与药剂对照无显著差异。
3 讨论
该研究通过生长速率法测定了微生物发酵液对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用，结果显示微生物发酵液能抑制灰霉菌菌丝的生长，其原液的抑制作用效果最好，抑制率为66.18%。在田间药效试验中，微生物发酵液原液在第3次施药后7 d对番茄灰霉病的防效最高，达60.47%，与35%腐霉利600倍液的药剂对照之间无显著差异。综合上述研究结果可以证实微生物发酵液对番茄灰霉病具有一定的防治效果。
目前，微生物发酵液中的纳豆芽孢杆菌主要应用在医学、保鲜、畜禽水产养殖等方面[20-21]，其发酵液中杀菌活性物质的研究多集中在次级代谢产物纳豆激酶、γ-聚谷氨酸以及一些脂肽类抗菌物质[22-23]。纳豆芽孢杆菌在农作物病害防治方面少有研究，而乳酸菌对番茄早疫病菌（Alternaria solani）、甜瓜疫霉菌（Phytophthora drechsleri Tucker）、苹果炭疽病（Glomer ellacingulated）、灰葡萄孢霉菌（Botrytis cinerea）、黄瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）的抑制作用已有人研究[11，24]。酵母菌被作为一种生防菌具有适应力强、定殖快、不产生抗菌素等优势。目前利用酵母菌来防治植物病害主要集中在果蔬采后病害的控制[15，17]。研究证明酵母菌可诱导番茄果实中防御相关酶活性增强番茄对灰霉病抗病能力[25]。由此看来，纳豆芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌混合微生物发酵液在农业杀菌剂的开发利用方面具有很大潜力，且作用范围较广。虽然，目前纳豆芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌这3种微生物各自的杀菌作用已有不少研究，但其混合发酵液的杀菌作用还很少有研究，且对于鲜食果蔬病害防治方面具有较高的研究价值。该试验证实了该微生物发酵液对灰霉病菌的杀菌效果，但其杀菌作用方式及对其他病原菌的杀菌作用效果还有待进一步研究。 47卷21期刘晓梅等 微生物发酵液对保护地番茄灰霉菌的抑制作用效果评价
参考文献
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关键词 微生物发酵液;灰霉菌;防治效果
中图分类号 S436.412.1+3文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）21-0145-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.043
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Control Effects of Microbial Fermentation Liquid on Tomato Gray Mould in Protected Field
LIU Xiaomei，LIANG Changdong，LI Jingfang et al
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Abstract [Objective] To study the effect of microbial fermentation liquid on controlling gray mould. [Method] Toxicity experiments and field trials were conducted. [Result] Toxicity experiments showed that the microbial fermentation liquid could significantly inhibit the growth of Botrytis cinerea， and the inhibition rate of the fermentation liquid was 66.18%. In the field trials， the control effect of microbial fermentation liquid on grey mold was 60.47% 7 days after the third treatment， which was no significant difference from the control effect of 600fold dilution of 35% saprophytic. [Conclusion] The microbial fermentation liquid had control effect on tomato Botrytis cinerea， as a new biological fungicide， it was worthy of further research， development and utilization.
Key words Microbial fermentation liquid;Tomato gray mould;Control effect
基金項目 连云港市财政专项（QNJJ1719）。
作者简介 刘晓梅（1987—），女，河南偃师人，助理研究员，硕士，从事植物保护研究。 通信作者，副教授，从事作物栽培及资源与坏境研究。
收稿日期 2019-07-17
番茄灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的真菌性气传病害。近年来随着保护地番茄种植面积的不断增加，灰霉病菌在土壤中大量累积，特别是在冬春季节最容易发生，且常暴发式扩增，严重影响番茄的产量和品质[1]，给农业生产带来巨大损失[2]。目前，保护地番茄灰霉病防治主要以化学药剂[3-4]为主，然而化学农药的长期施用往往会造成灰霉病菌的抗药性增加，且防治效果逐步降低[5-7]，另外还会导致病害的流行[8]。同时，化学农药残留问题比较严重，且越来越引起人们的关注，尤其是对鲜食果蔬，给环境及人畜健康带来严重威胁[9]。因此，探索生物新型杀菌剂来替代常规化学农药对保护地蔬菜种植具有积极的影响。
连云港市农业科学院资源与环境研究室制备的微生物发酵液是利用纳豆芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌进行发酵，而这3种微生物对多种病原菌均具有良好的杀菌效果，目前已有大量研究[10-18]，但其混合发酵液的杀菌作用效果还不明确。笔者通过室内毒力测定及田间药效试验进一步证实该微生物发酵液对保护地番茄灰霉病的杀菌效果，旨在为新型高效生物杀菌剂的开发和应用提供理论和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试番茄。番茄品种为中蔬四号，购于中国农业科学院蔬菜花卉研究所。
1.1.2 供试药剂。微生物发酵液由连云港市农业科学院资源与环境研究室提供，35%腐霉利悬浮剂购于四川宜宾川安高科农药有限公司。
1.1.3 病原菌。灰葡萄孢（Botrytis cinerea）斜面购于北京北纳创联生物技术研究院。
1.1.4 PDA培养基。马铃薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾3 g，硫酸镁1.5 g，维生素B1 10 mg，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。 1.2 方法
1.2.1 灰葡萄孢斜面转接。
从灰葡萄孢斜面取0.5 cm×0.5 cm正方形菌块接种在PDA平板培养基上，正置放入培养箱，25～28 ℃培养，待菌丝长满平板保存待用。
1.2.2 微生物发酵液对灰霉病菌菌丝生长抑制作用的测定。
采用生长速率法测定。将PDA培养基熔化，待冷却至45～50 ℃时，在无菌操作条件下倒入灭菌培养皿中，每皿10～15 mL培养基，摇匀后冷却凝固。将微生物发酵液配成不同浓度（原液、5倍、10倍、20倍、40倍稀释），以化学试剂腐霉利和清水作对照。取消毒烧杯，标记药剂名称及浓度，分别盛取药液，再用灭菌镊子夹取消毒滤纸片（直径4～5 mm）分别投入药液中，然后把浸透的滤纸片按顺序列于距培养基中央2.3 cm处，每皿放4片，并在培养皿底面加标签。夹取滤纸片时应在烧杯壁上停留片刻，让多余的药液流去。最后将 PDA 平板上培养7 d的灰葡萄孢霉打成直径 6 mm的菌饼，接种于 PDA 培养皿中央。每个处理5次重复。置于25 ℃左右恒温培养箱中培养，培养5 d后用十字交叉法测量菌落直径。
抑制百分率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径×100%
1.2.3 微生物发酵液对番茄灰霉病菌田间防治效果测定。
1.2.3.1 试验设计。
将微生物发酵液配成不同浓度（原液、5倍、10倍、20倍、40倍稀释），以腐霉利和清水作对照，选取长势一致3叶1心的植株幼苗作处理，每个处理20株，共3个重复。
1.2.3.2 施药时间与方法。
2019年1月3日第1次喷药，1月10日和1月17日进行第2、3次施药，共3次，采用小喷壶进行喷洒番茄植株叶正反面，做到湿而不滴。
1.2.3.3 调查方法和分级标准。
发病初期喷药前进行病情调查，每次施药后7 d调查病害情况。每小区5点取样，每点取5株，每株调查所有叶片上病斑面积占整株叶片的百分比进行分级。按以下[19]标准进行病害分级。根据病害调查结果计算病情指数和防治效果。数据采用邓肯氏新复极差法（DMRT）进行统计分析。
0级：叶片、果实无病;1级：病斑面积占整个叶、果面的5%以下;3级：病斑面积占整个叶、果面的6%～15%;5级：病斑面积占整个叶、果面的16%～25%;7级：病斑面積占整个叶、果面的26%～50%;9级：病斑面积占整个叶、果面的50%以上;
病情指数=100×[（各级病叶数×病害级别数）]/（调查总叶数×9）
防治效果=[1-（CK0×PT1）/（CK1×PT0）]×100%
式中，CK0为空白对照区施药前病情指数;CK1为空白对照区施药后病情指数;PT0为药剂处理区施药前病情指数;PT1为药剂处理区施药后病情指数。
2 结果与分析
2.1 微生物发酵液对番茄灰霉菌菌丝生长的抑制作用
采用生长速率法测定微生物发酵液对灰霉病菌菌丝生长的抑制作用。结果表明，微生物发酵液对灰霉病菌菌丝生长具有明显的抑制作用（表1），且抑制作用随着发酵液稀释倍数的增加而逐步降低，其中发酵液原液对灰霉病菌菌丝生长的抑制率最高达66.26%，其次是发酵液5倍稀释液、10倍稀释液且之间无显著差异，20倍、40倍稀释液抑制作用效果最小。
2.2 微生物发酵液对保护地番茄灰霉病的田间防治效果
微生物发酵液对保护地番茄灰霉病的防治效果（表2）表明，在第1次喷施后7 d，微生物发酵液原液对灰霉病菌的防效最高可达48.24%，与35%腐霉利600倍液药剂对照、微生物发酵液5倍稀释液均无显著差异;其次是发酵液10倍稀释液，防效最低的是20、40倍稀释液且两者之间无显著差异;第2次喷施后7 d，发酵液原液的防效达58.15%，显著低于35%腐霉利600倍液药剂防效72.10%，且显著高于发酵液其他稀释液处理组的防治效果，随着发酵液稀释倍数的增加防效逐渐降低，其中5倍与10倍稀释液，20倍与40倍稀释液处理之间的防效均无显著差异;第3次喷施后7 d，微生物发酵液原液的防治效果达60.47%，显著高于其他各稀释倍数处理，与35%腐霉利600倍液药剂处理的防治效果无显著差异。随着发酵液稀释倍数的增加防效逐渐降低，且20倍与40倍稀释液处理之间的防效均无显著差异。综上可知，在3次施药过程中，微生物发酵液不同处理组对番茄灰霉病的防治效果逐渐增加，发酵液原液在第3次喷药后与药剂对照无显著差异。
3 讨论
该研究通过生长速率法测定了微生物发酵液对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用，结果显示微生物发酵液能抑制灰霉菌菌丝的生长，其原液的抑制作用效果最好，抑制率为66.18%。在田间药效试验中，微生物发酵液原液在第3次施药后7 d对番茄灰霉病的防效最高，达60.47%，与35%腐霉利600倍液的药剂对照之间无显著差异。综合上述研究结果可以证实微生物发酵液对番茄灰霉病具有一定的防治效果。
目前，微生物发酵液中的纳豆芽孢杆菌主要应用在医学、保鲜、畜禽水产养殖等方面[20-21]，其发酵液中杀菌活性物质的研究多集中在次级代谢产物纳豆激酶、γ-聚谷氨酸以及一些脂肽类抗菌物质[22-23]。纳豆芽孢杆菌在农作物病害防治方面少有研究，而乳酸菌对番茄早疫病菌（Alternaria solani）、甜瓜疫霉菌（Phytophthora drechsleri Tucker）、苹果炭疽病（Glomer ellacingulated）、灰葡萄孢霉菌（Botrytis cinerea）、黄瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）的抑制作用已有人研究[11，24]。酵母菌被作为一种生防菌具有适应力强、定殖快、不产生抗菌素等优势。目前利用酵母菌来防治植物病害主要集中在果蔬采后病害的控制[15，17]。研究证明酵母菌可诱导番茄果实中防御相关酶活性增强番茄对灰霉病抗病能力[25]。由此看来，纳豆芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌混合微生物发酵液在农业杀菌剂的开发利用方面具有很大潜力，且作用范围较广。虽然，目前纳豆芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌这3种微生物各自的杀菌作用已有不少研究，但其混合发酵液的杀菌作用还很少有研究，且对于鲜食果蔬病害防治方面具有较高的研究价值。该试验证实了该微生物发酵液对灰霉病菌的杀菌效果，但其杀菌作用方式及对其他病原菌的杀菌作用效果还有待进一步研究。 47卷21期刘晓梅等 微生物发酵液对保护地番茄灰霉菌的抑制作用效果评价
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